多杀菌素发酵培养基优化及发酵工艺研究

和富明，田杰伟，刘文林，杨传伦，刘海玉，陈振发

(1.黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东 滨州 256500；2.京博农化科技有限公司，山东 滨州 256500）

多杀菌素(spinosad)是一种由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)通过好氧发酵产生的次级代谢产物。多杀菌素是一种大环内酯类抗生素，不但具有生物农药的安全性、环境友好性，还具有化学合成农药的速效性，其作用模式独特、自然分解快，是一种应用前景广阔的新型生物农药[1-2]。多杀菌素也是迄今为止发现的最有效和安全的杀虫抗生素，在农业生产上和粮食储藏中均具有良好的应用价值和广阔的市场前景[3-5]。

目前，国内齐鲁制药有限公司、浙江拜克生物科技有限公司、河北威远生物化工有限公司等6家公司于2015—2019年取得了多杀菌素的农药登记证书，但是仅有齐鲁制药有限公司于2020年8月在内蒙古自治区呼伦贝尔市阿荣旗正式投入生产。原因是生产工艺还不成熟，受菌种产素能力不高、发酵水平较低等因素限制，实现工业化生产仍然面临着生产技术和成本的双重难题[6-7]。

因此，如何提高产量依然是多杀菌素的研究重点。提高多杀菌素的产量主要从以下两方面开展工作：一是改变菌株自身的遗传性状。陈园等[8]以NTG（亚硝基胍）为诱变剂对刺糖多孢菌进行诱变，最终在诱变剂量2 mg·mL-1、处理时间50 min时获得产量提高43.96%的多杀菌素高产株；邬洋等[9]开展的10×MIC浓度的巴龙霉素抗性筛选研究中，抗性突变株的产量是原始菌株的2.2倍；党福军等[10]建立了刺糖多孢菌的基因敲除技术（即去除spnK编码保守区域序列），在工业菌株中构建了spnK失活的突变株，可以大量产生多杀菌素J和L；王海霞[11]通过等离子体诱变结合氯霉素、利福平、链霉素和庆大霉素抗生素组合进行多重抗性筛选，获得了1株高产菌株14-2，其多杀菌素发酵单位比诱变前提高了28.68%。二是通过外部条件的改变调控发酵过程。何思颖等[12]通过对11种常见碳源进行代谢途径分析，发现以5 g·L-1的甘露糖作为碳源添加时，显著提高丁烯基多杀菌素的产量1.78倍；邹球龙等[13]通过pH值调控补料分批发酵生产多杀菌素，其产量可达1.050 μg·mL-1，提高了82%。同时研究人员尝试添加油脂类、氨基酸类和有机酸类成分来满足刺糖多孢菌的生长需求，使得产生菌在原有发酵水平上有了较大幅度提高[14-18]。

本研究先利用正交试验对培养基成分进行优化，然后选择单因素试验对发酵工艺进行优化，以进一步提高多杀菌素产量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多杀菌素生产菌株Saccharopolyspora spinosa YJY-12，由黄河三角洲京博化工研究院有限公司精化材料生物研究所生物育种实验室筛选、保藏。

1.1.2 培养基 斜面培养基：葡萄糖7 g·L-1，饴糖10 g·L-1，酪蛋白胨3 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，MgSO42 g·L-1，琼脂20 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃灭菌20 min；

种子培养基：葡萄糖10 g·L-1，饴糖10 g·L-1，酵母浸粉20 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，黄豆饼粉15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，MgSO44 g·L-1，消前pH值6.9～7.3，121℃灭菌20 min；

基础发酵培养基：葡萄糖45 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯30 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉10 g·L-1，玉米浆干粉10 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，(NH4)2SO43 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH4)6Mo7O240.002 g·L-1，FeSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相应体积，灭菌前pH值调至7.3～7.5，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 从-80℃冰箱中取刺糖多孢菌甘油管，快速融化，接种至固体培养基，30℃培养8 d，活化菌种，形成孢子。

1.2.2 种子液培养 取活化后的平板，刮下孢子，制备孢子悬液，孢子悬液按1%～3%(V/V)的接种量接种至种子瓶培养基，温度30℃，转速220 r·min-1，培养至种子液呈土黄色，获取摇瓶种子液。

1.2.3 摇瓶发酵 将摇瓶中的种子液按照一定比例接种至装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵，温度30℃，转速220 r·min-1，培养至240 h，取样进行多杀菌素含量检测。

1.2.4 发酵培养基优化 前期通过单因素试验确定了基础发酵培养基组成，现通过软件正交试验设计助手设计正交试验L18(37)（如表1所示），对培养基中的各组成含量进行优化。

表1 正交试验因子与水平设定

1.2.5 种龄优化 分别将培养3～8 d的刺糖多孢菌种子液按照10%的比例接种至装有基础发酵培养基的摇瓶中进行发酵，pH值6.5，温度30℃，转速220 r·min-1，培养至240 h，取样进行多杀菌素含量检测。

1.2.6 接种量优化 将培养3 d的刺糖多孢菌种子液分别按照1%、5%、10%、15%的比例接种至装有基础发酵培养基的摇瓶中进行发酵，pH值6.5，温度30℃，转速220 r·min-1，培养至240 h，取样进行多杀菌素含量检测。

1.2.7 发酵温度优化 将培养3 d的刺糖多孢菌种子液按照10%的比例接种至装有基础发酵培养基的摇瓶中进行发酵，pH值6.5，转速220 r·min-1，温度分别为26、28、30、32℃，培养至240 h，取样进行多杀菌素含量检测。

1.2.8 发酵pH值优化 将培养3 d的刺糖多孢菌种子液按照10%的比例接种至装有基础发酵培养基的摇瓶中进行发酵，用稀盐酸溶液调节培养基pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，温度30℃，转速220 r·min-1，培养至240 h，取样进行多杀菌素含量检测。

1.2.9 多杀菌素提取及含量检测 取发酵液1 mL，加无水乙腈4 mL，充分振荡30 min，10 000 g离心10 min，取上清液，通过HPLC测定多杀菌素的发酵水平。

液相条件：C18反相柱(250 mm×4.0 mm，5 μm)，流动相为V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（0.05%乙酸铵水溶液）＝45∶45∶10；流速1.0 mL·min-1，波长250 nm，温度35℃。

1.3 验证试验

按照优化后的培养基配方配制培养基，设为试验组，接种刺糖多孢菌，应用优化后的培养条件进行培养；同时设置对照组，将刺糖多孢菌接种基础发酵培养基，同等条件下进行培养；培养至240 h，分别取样进行多杀菌素含量检测。

1.4 数据处理与分析

采用正交设计助手进行正交试验设计及结果分析，运用Origin软件对单因素试验结果进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优化

本研究利用正交设计助手设计了七因素三水平的正交试验，对基础发酵培养基的主要成分的含量进行优化，以多杀菌素含量为响应值确定最适培养基配方，试验结果如表2、表3所示。

表2为试验结果的直观分析，表3为试验结果的方差分析，从不同因素所对应的极差值可以看出，因素A（葡萄糖）对多杀菌素含量影响最大，其次为C（油酸甲酯），其余因素从大到小依次为G（(NH4)2SO4）、F（蛋白粉）、B（棉籽蛋白）、D（酵母粉）、E（玉米浆干粉）。试验得出优化后的培养基组合为葡萄糖55 g·L-1、棉籽蛋白30 g·L-1、油酸甲酯40 g·L-1、酵母粉10 g·L-1、玉米浆干粉5 g·L-1、蛋白粉15 g·L-1、(NH4)2SO41 g·L-1，发酵后的多杀菌素含量最高可达2.155 g·L-1。

表2 发酵培养基优化正交试验直观分析

表3 正交试验方差分析

2.2 种龄优化

在抗生素等次级代谢产物的发酵中，种龄会对发酵结果产生较大的影响。种龄过高，虽然菌丝量会增加，但种子培养基中养分耗竭而使菌丝逐渐趋于老化，影响接种后其在发酵培养基中的活力，最终会导致产物含量的降低。种龄过低，菌丝量太少，同样会影响发酵产量。

刺糖多孢菌种龄对多杀菌素发酵产量的影响如图1所示，刺糖多孢菌种子液培养至第4天时，多杀菌素产量最高，为2.231 g·L-1。种龄3 d的多杀菌素含量为1.356 g·L-1，这说明随着时间的延长，种子液中的菌体量逐渐提高，且活力较高，接种后能在发酵培养基中迅速生长，缩短延滞期。种龄大于4 d后，多杀菌素产量逐渐降低，尤其是在第8天，多杀菌素产量仅为0.893 g·L-1，此时菌体衰老较为严重，影响次级代谢的酶活力，进而引起发酵异常，不利于抗生素的生物合成。

图1 种龄对多杀菌素发酵产量的影响

2.3 接种量优化

微生物的初始细胞浓度会影响微生物繁殖的启动时间，较大的接种量有利于微生物快速进入对数生长期，而较小的接种量将会延长微生物生长的延滞期，繁殖启动较晚，进而影响产物的合成。

刺糖多孢菌接种量对多杀菌素发酵产量的影响如图2所示，当接种量为5%时，多杀菌素产量最高为2.023 g·L-1。刺糖多孢菌初始接种量过高，菌丝过早生长，消耗培养基中营养成分，影响次级代谢产物的生长，不利于多杀菌素的合成。接种量过低，则会引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，导致发酵异常等。

图2 接种量对多杀菌素发酵产量的影响

2.4 发酵温度优化

微生物的生长和抗生素的合成等代谢活动都是在各种酶的催化下进行，而酶的催化作用需要有适宜的温度。从酶反应动力学来说，随着温度的升高，酶的活性加强，反应速率加快，生长代谢加快，抗生素分泌期提前，但温度过高，则会影响酶的活性，菌体迅速衰老，发酵周期缩短，抗生素含量降低。因此维持微生物的生长和抗生素的合成所需要的最适温度是提高抗生素发酵水平的重要条件[19]。

温度对多杀菌素发酵产量的影响如图3所示，刺糖多孢菌发酵产多杀菌素的最适温度为28℃，多杀菌素产量为2.224 g·L-1。

图3 发酵温度对多杀菌素发酵产量的影响

2.5 发酵pH值优化

pH值对刺糖多孢菌发酵产多杀菌素的影响如图4所示，pH值在6.0～7.0之间时随着pH值的增加，多杀菌素含量逐渐提高，并在pH值7.0时产量达到最高，为2.145 g·L-1，继续提高pH值，多杀菌菌素含量略有降低，说明刺糖多孢菌发酵产多杀菌素的最适pH值为7.0。

图4 pH值对多杀菌素发酵产量的影响

2.6 验证试验

优化后的培养基配方：葡萄糖55 g·L-1，棉籽蛋白30 g·L-1，油酸甲酯40 g·L-1，大豆油15 g·L-1，酵母粉10 g·L-1，蛋白粉15 g·L-1，玉米浆干粉5 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，（NH4)2SO41 g·L-1，CuSO40.002 g·L-1，(NH)6Mo7O240.002 g·L-1，FeSO40.002 g·L-1，THIX-298 1 mL·L-1，CaCO35 g·L-1，加水定容至相应体积，灭菌前pH值调至7.3～7.5，121℃灭菌20 min。

优化后的培养条件：刺糖多孢菌种龄4 d，接种量10%，摇床温度28℃，转速220 r·min-1，培养240 h。

利用优化后的培养基和培养条件进行刺糖多孢菌的培养，发酵结束后进行多杀菌素含量测定。如表4所示，对照组多杀菌素含量为1.823 g·L-1，试验组多杀菌素含量为2.625 g·L-1，优化后多杀菌素含量提高了43.99%。

表4 验证试验结果

3 结论与讨论

本研究将本实验室保存的刺糖多孢菌YJY-12用于发酵产多杀菌素的优化试验，首先通过正交试验，对基础发酵培养基中的主要成分进行优化，得到最佳的培养基组成，并得到各组分对多杀菌素合成的影响效果，从大到小依次为葡萄糖＞油酸甲酯＞（NH4)2SO4＞蛋白粉＞棉籽蛋白＞酵母粉＞玉米浆干粉。通过试验对刺糖多孢菌发酵工艺进行优化，得到最适刺糖多孢菌发酵产多杀菌素的条件为种龄4 d，接种量5%，温度28℃，pH值7.0。通过验证试验比较了对照组与优化后的试验组的多杀菌素含量，研究结果显示，对照组多杀菌素含量为1.823 g·L-1，试验组多杀菌素含量为2.625 g·L-1，优化后多杀菌素含量提高了43.99%。

多杀菌素是一种极具前景的新型农用抗生素，因此，研发成熟的多杀菌素工业化生产工艺具有极重要的意义。张瀚等[20]利用1株通过基因重排获得的诱变菌株进行试验，得到影响该菌株发酵生产多杀菌素的最佳油脂为山茶油，且在0 h添加15.0 g·L-1效果最好。通过培养基成分响应面试验获得优化发酵培养基，并在5 L的发酵罐中通过补料分批发酵，使多杀菌素产量达到了512.36 mg·L-1，诱变株的多杀菌素产量显著提高。由以上研究结果可以看出，虽然其发酵水平较低，但却提供了一种较为全面的研究思路，即对现有菌株进行基因改造，并围绕发酵培养基中的重要组分进行深入试验，将有可能使多杀菌素的发酵水平得到新的突破。

本研究为刺糖多孢菌发酵提供了可靠的发酵培养基配方及发酵工艺，实现了多杀菌素增产目标，为加快多杀菌素的工业化生产提供了有益的参考。