天津地区黄瓜中风险性食源性致病菌污染水平分析

于海涛，刘 娜，李瑞环，徐石勇，黄凤军，赵 新

（1.天津市农业科学院 种质资源与生物技术研究所，天津 300381；2.天津市东丽区产品质量监督检验所，天津 300300）

随着消费者生活水平的提高以及日常饮食习惯的多样化，食品安全问题日渐成为社会关注的焦点[1]。据世界卫生组织（WHO）统计，在全球范围内每年约6亿人患食源性疾病，因其导致死亡的人数约42万人[2]。研究表明，微生物也是我国食源性疾病的主要诱发因素，其潜在的食品安全隐患不容忽视[3-5]。

食源性致病菌在自然界分布广泛，近几年国内外已发生多起由食源性致病菌引起的生物安全事件[6-11]。例如，2016年美国因黄瓜暴发沙门氏菌疫情[12]，导致至少907人感染，其中6人死亡，204人住院。2000年日本金黄色葡萄球菌肠毒素导致的“血印乳品”事件[13]，14 000多人受感染，国内外金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒每年都有发生[14]。由此可见食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，因此调查即食生鲜果蔬中的病原微生物显得尤为重要。

黄瓜作为北方居民餐桌上常见的蔬菜，多以生食为主，因其营养丰富，深得广大消费者的喜爱。由于其表面不光滑，纹路较多，很容易寄生各种细菌，另外黄瓜生长期较短，成熟过程中需要的肥料、灌溉水和土壤也是黄瓜中的食源性致病菌的主要来源[15-19]。因此，加大对黄瓜及种植投入品中的食源性致病菌筛查也十分重要。

本研究通过采集天津地区生产环节和市场环节的黄瓜样本，对其进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及大肠杆菌O157∶H7的测定，确定天津地区黄瓜的主要风险因子为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，由于国内外至今暂未发布沙门氏菌的定量检测标准，本研究仅对有定量检测标准的金黄色葡萄球菌进行监测，通过应用IPMP 2014对金黄色葡萄球菌构建预测生长模型[20]，通过@Risk6风险评估软件对其进行QMRA污染水平分析[21-22]，最终提出合理性建议，保证消费者的食用安全。

1 材料和方法

1.1 样品采集

2017—2019年，在天津市西青区选择2个黄瓜生产基地作为采样点，按照无菌采样原则采集60份黄瓜样本及38份基质、井水、营养液等基地交叉污染样本。并在天津市南开区、河西区、河北区、河东区、西青区和东丽区的大型农贸市场，按无菌采样原则随机采集黄瓜样本98份。以上样品均用无菌袋封闭，放于低温样品箱中保存，在6 h内运至实验室，24 h内完成检测。

1.2 培养基与仪器设备

缓冲蛋白胨水（BPW），四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，亚硫酸铋（BS）琼脂，HE琼脂，木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，生化鉴定试剂盒；7.5%氯化钠肉汤，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板；李氏增菌肉体LB（LB1，LB2），1%盐酸吖啶黄溶液，1%萘啶酮酸钠盐，PALCAM琼脂，生化鉴定试剂盒；改良EC肉汤，改良山梨醇麦康凯琼脂，大肠埃希氏菌O157显色琼脂，生化鉴定试剂盒等均购自北京陆桥技术有限责任公司。

拍击式均质器（上海之信仪器有限公司），全自动高压灭菌锅（日本YAMATO有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒有限公司），电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），电动移液器（Thermo有限公司），生物安全柜（ESCO公司），超净工作台（苏州金燕净化设备有限公司），OLYMPUS CX31显微镜（奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 致病菌筛查 黄瓜及基地交叉污染样本中沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特氏菌及大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定分别基于国家标准GB/T 4789.4—2016，GB/T 4789.10—2016，GB/T 4789.30—2016，GB/T 4789.36—2016[23-26]。

1.3.2 膳食问卷调查 针对天津地区的居民设计1份调查问卷，采用随机发放的原则选取100人进行膳食调研，问题包括购买黄瓜后当天食用量、存放温度、存放时间、家庭用餐人数、人均每餐食用量、人均每星期黄瓜食用次数、常去摊位日销量，由此了解天津地区居民对黄瓜的消费情况。

1.3.3 预测模型构建 无菌环境下将黄瓜切成小丁，紫外灭菌30 min，称取20 g于无菌均质袋中，再用无菌吸管吸取1 mL浓度为2×104CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌均匀的接种于均质袋中的黄瓜丁上，使黄瓜丁的带菌量为1×103CFU·mL-1。将接种后的黄瓜丁分别放于10、15、20、25、30、35℃的培养箱中培养，按照预定时间间隔取样，进行菌落计数。应用IPMP 2014中的Huang Model对试验数据进行生长曲线的拟合，建立一级预测模型，其中一级预测模型（Huang Model）的表达式为：

式中，t，时间(h)；Y(t)，t时的菌数(ln CFU·g-1)；Y0，初始菌数(ln CFU·g-1)；Ymax，最大菌数(ln CFU·g-1)；μmax，最大比生长速率(ln CFU·g-1·h-1)；λ，延滞期时间（h）；α，延滞期变异系数为4。

应用IPMP 2014中的Arrhenius-type对金黄色葡萄球菌的最大比生长速率与温度进行生长曲线的拟合，建立二级预测模型，其中二级预测模型（Arrhenius-type）的表达式为：

式中，μmax，最大比生长速率(ln CFU·g-1·h-1)；T，特定生长温度(℃)；R，气体常数（8.134 J·mol-1）；△G’，与细菌生长有关的一种动能；a和n，模型的参数。

1.3.4 污染水平分析 为便于计算，当黄瓜试样中金黄色葡萄球菌浓度低于最低检出限时，假设金黄色葡萄球菌菌量为最低检出限的50%(5 CFU·g-1)。定性阳性，而定量为阴性的黄瓜试样，实际待菌量低于10 CFU·g-1时，假设金黄色葡萄球菌菌量为10 CFU·g-1。结合IPMP 2014构建的一级模型、二级模型及膳食调查结果，获得不同温度条件下金黄色葡萄球菌的最大比生长速率。应用@Risk 6风险评估软件设置变量参数，进行黄瓜中金黄色葡萄球菌定量风险评估，结合现有数据分析黄瓜中金黄色葡萄球菌污染水平。

2 结果与分析

2.1 筛查结果

对采集的黄瓜样本及基地交叉样本进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及大肠杆菌O157∶H7筛查，经检验仅市场环节的黄瓜中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有不同程度的检出，金黄色葡萄球菌检出比例为2/196，污染量分别为210、3 000 CFU·g-1；沙门氏菌检出比例为1/196。致病菌筛查结果如表1所示。

表1 天津地区黄瓜中致病菌筛查结果

2.2 膳食调查结果

根据天津地区居民食用黄瓜的消费习惯，并结合@Risk 6软件对风险因素的分析，设置7道问题，随机抽取100人进行调研，具体汇总结果如表2。

表2 问卷调研结果汇总

2.3 预测模型构建

通过建立不同温度条件下黄瓜中金黄色葡萄球菌的生长模型，每隔一定的时间进行沙门氏菌定量检测，获得其在10、l5、20、25、30、35℃下的生长数据，应用IPMP软件进行拟合，以定量描述特定环境条件下对金黄色葡萄球菌在黄瓜上的生长、残存和死亡动态，从而对金黄色葡萄球菌的存活情况做出较为科学的预测，为监控即食黄瓜的食品安全和风险评估提供参考，为下一步的风险概率分析提供了技术支撑，具体模型见图1、图2。

图1 黄瓜中金黄色葡萄球菌二级模型

图2 黄瓜中金黄色葡萄球菌一级模型

2.4 污染水平分析

研究表明，食物中金黄色葡萄球菌的浓度大于105CFU·g-1时即可产生致病的肠毒素[27]，引发食物中毒，出现呕吐、恶心、腹痛、腹泻等症状。因此，把105CFU·g-1认为导致金黄色葡萄球菌食物中毒的最小浓度。

结合黄瓜中金黄色葡萄球菌的筛查结果、家庭食用黄瓜的膳食调研结果、金黄色葡萄球菌食物中毒诊断标准（105CFU·g-1）以及金黄色葡萄球菌预测模型参数，设置黄瓜中金黄色葡萄球菌QMRA污染水平分析，模型中的参数分布均以@Risk 6软件的语法设立，具体见表3。经@Risk 6软件10 000次迭代模拟天津地区黄瓜食用时金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布为86.0%在0.00～5.00 log CFU·g-1，超过中毒诊断标准5.00 log CFU·g-1的风险概率为14.0%，具体见图3。

表3 污染水平QMRA模型

图3 黄瓜中金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布

针对天津地区黄瓜的初始污染水平筛查结果，应用@Risk 6风险评估软件，笔者发现，贮藏温度、贮藏时间、最大生长量与污染比例/概率分布的相关系数依次为0.73、0.61、0.03，其中贮藏温度/概率分布相关性最大，其次为贮藏时间，如图4所示。

图4 黄瓜中金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布相关系数

为了降低风险概率，参考最终污染量/概率分布相关系数，控制关键变量，如将贮藏时间严格控制在24 h食用完毕，经@Risk 6软件10 000次迭代，模拟天津地区居民食用黄瓜时金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布为94.0 %在5.00 log CFU·g-1以下，超过中毒诊断标准5.00 log CFU·g-1的风险概率为6.0%，具体见图5；如将贮藏温度严格控制在冰箱6℃保存，金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布为99.0%在5.00 log CFU·g-1以下，具体见图6。因此，控制相关性最大的贮藏温度，可有效地保证天津地区的黄瓜在现有100份居民食用习惯调研数据下的食用安全性。

图5 黄瓜24 h食用完毕黄瓜中金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布

图6 黄瓜冰箱6℃贮藏方式下金黄色葡萄球菌的最终污染量/概率分布

3 结论与讨论

近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒事件不断增加，食源性疾病日渐成为威胁人们健康和生命安全的关键因素，国内外一些实验室已对食源性致病菌的定量风险评估进行试验[28-30]。本研究通过对天津市生产环节、市场环节的黄瓜进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌及大肠杆菌O157∶H7的检测，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有不同程度的检出，检出比例分别为2/158和1/158，其他2种菌均未检出，确定天津地区黄瓜中的主要风险因子为金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。虽检出比例不高，但对天津地区即食生鲜果蔬的食品安全来说仍存在一定的风险隐患。

本研究通过对生产环节和市场环节的黄瓜进行食源性致病菌的筛查，并对主要风险因子进行污染水平分析，其试验数据可为居民食用提供参考。但还缺少对种植、运输过程中金黄色葡萄球菌的评估，不能对黄瓜“农田到餐桌”的全程进行定量风险评估，在未来的试验中还需进一步完善。

通过应用@Risk6风险评估软件，设置黄瓜中金黄色葡萄球菌QMRA污染水平分析，笔者发现，贮藏温度与最终污染量/概率分布相关性最大，其次为贮藏时间。因此，建议居民最好在购买黄瓜后全部冰箱低温保存，以降低微生物的生长速度，有效降低居民食用黄瓜感染金黄色葡萄球菌的风险概率；其次，如果不能满足冰箱保存的条件，建议居民在购买后24 h内食用完毕，以保障居民的食用安全。