正清风痛宁治疗神经病理性疼痛的动物模型研究*

许牧 鄢毅 吴志圣 王志剑 朱梦叶

神经病理性疼痛是慢性疼痛，在临床较为常见，诱发因素为躯体感觉系统的疾病或损伤，对患者精神、睡眠及生活质量造成严重不良影响，给家庭及社会带来巨大的负担[1]。现阶段，药物治疗是主要方法，主要包括三环类抗抑郁药、抗癫痫药、阿片类等药物[2]。但是，从总体上来说，这些药物缺乏理想的治疗效果，同时伴一定程度的不良反应[3-4]。神经病理性疼痛发生机制复杂，神经损伤后继发的神经源性炎症是神经病理性疼痛发生的重要机制之一。既往研究表明，脊神经损伤后，小胶质细胞和星形胶质细胞活化并释放白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子，从而促进神经病理性疼痛的发生[5-6]。传统中药正清风痛宁主要药用成分为盐酸青藤碱，临床主治风湿与类风湿性关节炎等[7-9]，具有良好的抗炎及调节免疫的作用，已证实在多种炎症疼痛中发挥良好的镇痛效应。青藤碱可以抑制类风湿性关节炎患者外周血单核细胞合成白细胞介素-8（IL-8）和IL-1β[10]。笔者认为神经病理性疼痛发病机制与青藤碱的作用机制有高度重叠，推测其针对神经病理性疼痛应有治疗效果，具有无明显副作用的优势，用于神经病理性疼痛的治疗有明显的优势。本研究通过建立神经病理性疼痛动物模型，通过应用行为学、分子生物学等多种实验方法，为进一步研究其机理提供依据，并为传统中药正清风痛宁开发新用途和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：30 只C57BL/6 雄性小鼠，6～8 周龄，20～30 g。实验试剂：取适量正清风痛宁（生产厂家：湖南正清制药集团股份有限公司，批准文号：国药准字Z10980043，规格：20 mg），在室温下生理盐水充分溶解，得到正清风痛宁实验用液（4 mg/mL）。

1.2 方法

1.2.1 神经病理性疼痛小鼠模型的建立及分组 取30 只20～30 g 雄性C57BL/6 小鼠，将其随机分成3组，实验组[建模后给予鼻饲40 mg/（kg·d）正清风痛宁]、模型对照组（建模后给予鼻饲生理盐水0.2 mL/d）、假手术组（在小鼠身上开切口，未真正进行手术，术后给予鼻饲生理盐水0.2 mL/d）。三组小鼠术前术后均正常饲养。建模过程：用异氟醚对其进行麻醉后，于小鼠右侧股段高位将皮肤切开，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经干，在坐骨神经干上用7-0 尼龙丝线结扎3次，间隔1 mm，结扎完后将坐骨神经解剖学归位，逐层缝合至皮肤，该过程在无菌操作下进行。小鼠术后均用单笼饲养。若小鼠术后出现下肢瘫痪、运动障碍或死亡，则需剔除，更换新的小鼠进行建模，建模成功的标准为小鼠有自发痛、触发痛、痛觉过敏，感觉减退和感觉倒错等。三组鼻饲给药，于术后第3 天开始给药，连续给药至术后第14 天。

1.2.2 小鼠机械缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）测定 术前及术后1、3、5、7、10、14 d 均需测定小鼠PWMT，对比分析各组小鼠PWMT。检测方法：采用Von-Frey 触觉测痛仪对小鼠PWMT 进行评估。将待测小鼠放进镂空的金属笼子中20～30 min 使其充分适应环境，之后采用Von-Frey 触觉测痛仪对小鼠建模侧后跖中部进行刺激，采用Up and down 方法，即克数递减或递增的方式进行测试，每次持续6～8 s，重复10次，每2 次测试间隔应在15 s 以上。阳性标准为10 次检测中有5 次及以上舔爪反应或缩爪反应出现，缩爪阈值为阳性反应的最小克数。

1.2.3 小鼠热刺激缩足反应潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）测定 采用足底热辐射热检测仪评估术前及术后1、3、5、7、10、14 d小鼠PWTL，运用Hargreaves法，应用卤钨灯发出的辐射刺激小鼠后跖，小鼠热痛阈为小鼠舔足掌、缩爪或跳开的时间。测定过程中，在升高的半透明有机玻璃笼中放置小鼠，有机玻璃笼规格为20 cm×20 cm×25 cm，适应环境约30 min，控制室温在（24±2）℃，保持环境安静。应用50 W，8 V灯泡发出的辐射热对小鼠患侧后跖进行照射，每只5次，计算平均值。将照射时间上限值预先设定为20 s，以有效避免灼伤小鼠足底皮肤。

1.2.4 术后14 d 检测IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎症介质 术后14 d 处死各组小鼠，采取各组小鼠脊髓腰骶膨大处组织匀浆，通过ELISA 双抗体夹心法检测IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎症因子水平，具体操作按所购NeoBioscience 公司ELISA 试剂盒说明书步骤进行。开始实验前20 min 从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。取出足够数量的平衡至室温的酶标包被板，设置标准品孔和空白孔、待测标本孔。将100 μL 标准品加入标准品孔中，先将标本（大鼠脊髓腰骶膨大处组织匀浆）100 μL 加入待测标本孔中；空白孔不加。用封板胶纸将各孔封住，在37 ℃恒温箱中孵育1.5 h。洗板5 次。将100 μL 生物素化抗体工作液加入每孔，将生物素化抗体稀释液加入空白孔，将各孔封住。在37 ℃恒温箱孵育1 min。重复洗板5 次。将100 μL 酶结合物工作液加入各孔，将酶结合物稀释液加入空白孔，封板，在37 ℃恒温箱避光孵育30 min，洗板5 次。将100 μL 显色底物加入每孔，在37 ℃恒温箱避光孵育15 min。将100 μL 终止液加入各孔，混匀后采用酶标仪对CD450 值进行即刻测量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料用（）表示，组间比较采用单因素方差分析，行为学比较采用重复测量方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠PWMT 比较 分别在术前及术后1、3、5、7，10、14 d 检测各组小鼠的PWMT。从CCI 术后1 d 开始，模型对照组小鼠的PWMT 明显低于假手术组（P＜0.05）。相比于模型对照组，术后第3 天起给予正清风痛宁40 mg/（kg·d）后，从术后7 d起实验组小鼠的PWMT 明显升高（P＜0.05），见图1、表1。

图1 三组小鼠PWMT比较（n=10）

表1 三组小鼠PWMT比较[g，（）]

表1 三组小鼠PWMT比较[g，（）]

※与假手术组比较，P＜0.05；＃与模型对照组比较，P＜0.05。

2.2 三组小鼠PWTL 比较 分别在术前及术后1、3、5、7、10、14 d 检测各组小鼠的PWTL。从CCI术后1 d 开始，相比于假手术组，模型对照组小鼠的PWTL 明显缩短，差异均有统计学意义（P＜0.05）。相比于模型对照组，术后第3 天起给予正清风痛宁40 mg/（kg·d）后，从术后7 d 起实验组小鼠的PWTL 明显延长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 三组小鼠PWTL比较（n=10）

表2 三组小鼠PWTL比较[s，（）]

表2 三组小鼠PWTL比较[s，（）]

※与假手术组比较，P＜0.05；＃与模型对照组比较，P＜0.05。

2.3 三组小鼠脊髓组织炎症因子水平比较 Elisa检测各组小鼠脊髓中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达水平。模型对照组小鼠脊髓中的TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平均明显高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。相比于模型对照组，实验组小鼠脊髓中TNF-α、IL-1β和IL-6 的表达水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 三组小鼠脊髓组织炎症因子水平比较（n=10）

表3 三组小鼠脊髓组织炎症因子水平比较[pg/mL，（）]

表3 三组小鼠脊髓组织炎症因子水平比较[pg/mL，（）]

3 讨论

正清风痛宁主要成分为青藤碱，是从防己科植物青风藤和毛青藤中提取出来的，属于一种生物碱，具有通络、止痛、祛风湿之功效，临床上对于治疗腰椎疾病、颈椎疾病、漏肩风病及骨关节炎等均有比较明显的疗效[11]。中医药学应用青风藤或其复方治疗风湿性疾病已有一千多年的历史。早在宋朝《图经本草》和明朝《本草纲目》上记载：“青风藤主治风疾，治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿入，药酒中用”[12]。《本草汇言》记载“青风藤散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，正骨利髓，故风病软弱无力，并劲强偏废之证，久服常服，大建奇功”[13]。根据中医关于“痹症”的病因机制和中药关于青藤碱性温味苦、气平、无毒，有祛风湿、通经络、利水止痛的功效论述，采用青藤碱治疗风湿类疼痛效果明显[14]。

近年来，随着现代医药技术的不断发展，对于正清风痛宁（青藤碱）的药物作用机制有着越来越深入的了解。有研究证实其有免疫调节、抗炎、抗肿瘤及镇痛作用[15]。青藤碱可以通过调节Treg 与Th17 细胞的平衡，影响炎症因子的合成，有效改善胶原诱导的关节炎大鼠模型的症状[16]。有研究发现，青藤碱可诱导人肺癌细胞A549 凋亡，抑制其侵袭[17]。有研究发现，青藤碱能够抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖，其作用机制可能是通过抑制COX-2 表达，从而影响血管内皮生长因子（VEGF）的表达和释放[18]。目前对于青藤碱的免疫调节、抗炎及抗肿瘤作用，国内外已有大量文献报道，但对于青藤碱抑制疼痛及其相关机制报道甚少。有研究发现，青藤碱在小鼠糖尿病性神经痛模型中可抑制脊髓背根神经节P2X3 受体的上调表达和活化，减轻大鼠中P38MAPK 活化而增强的痛觉过敏[19]。另外有研究证实，青藤碱诱导镇痛作用的另一种解释是阻滞酸敏感离子通道和L 型钙通道，可以减少与疼痛相关信号神经元的激活。此外，有关研究指出，青藤碱对小胶质细胞的活化具有抑制作用[20]。同时青藤碱可改善慢性疼痛后继发抑郁行为。这些研究均提示青藤碱可能对神经病理性疼痛的外周及中枢免疫反应可能具有良好的调控作用，同时有改善慢性疼痛后继发焦虑情绪的可能。

目前已有临床及基础研究证实，青藤碱可有效抑制小胶质细胞的活化及脊髓背根神经节P2X3 受体的上调表达和活化，且长期使用无明显耐药性[21]。以上均提示正清风痛宁对神经病理性疼痛的外周及中枢免疫反应可能具有良好的调控作用。在本研究中，笔者建立小鼠神经病理性疼痛模型，通过正清风痛宁观察其治疗小鼠神经病理性疼痛，实验结果表明正清风痛宁可以改善CCI 致小鼠神经病理性疼痛，并减少小鼠脊髓炎症因子表达水平，其缓解疼痛的机制可能与下调炎症因子相关。正清风痛宁治疗神经病理性疼痛仍需更多的基础及临床试验，进一步验证其在神经病理性疼痛中的应用。