乳酸菌对嗜水气单胞菌体外抑制作用试验

李 欢，邓舜洲，朱芝秀

江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类利用可发酵糖产生乳酸的细菌的总称，能耐受动物胃肠道内的酸性环境，广泛分布在恒温动物和鱼类胃肠道中[1]。近年来，人们对生活水平的要求日益严格，在我国的大部分地区，尤其是南方的城市中，乳酸菌的应用已经成为一大热潮。目前，乳酸菌在食品加工行业、医疗保健行业、畜禽水产养殖行业中大量应用[2-3]。尤其是以乳酸菌为代表的微生态制剂，因其具有维持动物肠道微生物平衡、预防疾病、促进生长、提高饲料转化率和改善畜禽饲养环境等作用，日益成为各大饲料加工企业和畜禽养殖业关注的焦点。其中，从鱼类肠道提取的具有抑菌效果的乳酸菌，可通过生物拮抗作用调节肠道微生物的生态环境、增强肠道上皮细胞的屏障层、提高动物的免疫机能，对各种鱼类的营养改善、免疫增强以及疾病防治都具有重要的作用[4]。

随着人们生活水平的不断提升，水产养殖业的安全性也受到了重视，嗜水气单胞菌因其感染暴发力强、致病率高、传染速度快等特点成为了对水产养殖业有重要危害的病原菌，如何在水产养殖业中防治嗜水气单胞菌成为一大焦点问题[5]。目前，临床上对于嗜水气单胞菌的防治仍以抗生素治疗为主，然而抗生素治疗带来的药物残留以及细菌耐药性的出现，引起了国内的重视。近日来，国家开始实施《饲料和饲料添加剂管理条例》（国务院令第609号），以及即将施行《新食品安全法》，预示着国家将进一步加强对企业生产的监管，尤其是对饲料添加剂、药物添加剂使用的监管。因此，如何在降低成本的同时提高产品的安全性与品质，已经成为新形势下对畜禽养殖者及饲料加工企业的重大考验。同时，饲料添加剂的选择和应用成为关键。因此，本试验对鱼源乳酸菌进行水产主要病原菌嗜水气单胞菌体外抑制试验，并进一步开展抑制作用影响因素的试验，拟为减少抗生素的药物残留问题提供解决方案以及鱼源乳酸菌在水产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验用菌。嗜水气单胞菌C-1、C-2、C-3，鱼源乳酸菌Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13：均由江西农业大学动科院预防兽医教研室提供。

2）主要仪器。电热恒温培养箱（型号为HH.BII.420BS），购自上海跃进科学仪器厂；立式自动电热压力蒸气灭菌锅（型号为LDZX-40BI），购自上海申安医疗器械厂；数显游标卡尺，购自上海上工仪器有限公司；超净工作台，购自苏州净化集团；牛津杯：购自上海申源科学仪器有限公司。

3）主要试剂。乳酸菌MRS 培养基、普通琼脂培养基、溴甲酚紫蛋白胨培养基：均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 方 法

1）鱼源乳酸菌体外抑菌试验。

①嗜水气单胞菌CFU 检测。无菌操作，将嗜水气单胞菌C-1、C-2、C-3接种于普通肉汤，培养24 h 后，按10-1倍递减稀释至10-10，用移液器取0.2 μL 的各稀释度于平板上，置于37 ℃恒温箱中培养48 h，测定嗜水气单胞菌CFU。

②鱼源乳酸菌对嗜水气单胞菌体外抑制试验。按照琼脂扩散法，将鱼源乳酸菌Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13 接种于MRS 肉汤，37 ℃震荡48 h。将嗜水气单胞菌C-1、C-2、C-3培养液分别稀释为1×105，均匀涂布于普通琼脂培养基表面，将牛津杯等距离放置其上，用注射器将Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13 培养液上清液按一定顺序缓慢注入牛津杯中，放于4 ℃冰箱，待菌液全部扩散完毕后放于37 ℃恒温箱培养24 h，测量并记录抑菌圈大小。

2）鱼源乳酸菌体外抑制作用的影响因素。

①乳酸菌产酸强度与抑制作用相关性。无菌操作，将6 株乳酸菌分别点种于溴甲酚紫蛋白胨培养基，放入37 ℃恒温箱中培养48 h，每天观察产酸圈的大小，并用游标卡尺测量产酸圈的直径，并与乳酸菌体外抑菌试验结果进行比对，寻找产酸圈与抑菌圈之间的关系，探求乳酸菌产酸强度与抑制作用相关性。

②嗜水气单胞菌浓度与抑制作用相关性。按照琼脂扩散法，取C-1的不同稀释液为试验菌液，均匀涂布在普通琼脂培养基表面，将牛津杯等距放置于平板上，用注射器将Y-2、Y-6、Y-11 培养液分别缓慢注入牛津杯中，放入4 ℃冰箱，待菌液全部扩散完毕后置于37 ℃恒温箱培养24 h，测量并记录抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 鱼源乳酸菌体外抑菌试验

1）嗜水气单胞菌CFU 检测，C-1CFU 为1.3×105，C-2CFU 为9×106，C-3CFU 为1.1×108。

2）鱼源乳酸菌体外抑制试验结果（表1、图1）：Y-6>Y-2>Y-11>Y-10>Y-7>Y-13。

表1 乳酸菌对嗜水气单胞菌的抑菌结果 mm

2.2 鱼源乳酸菌体外抑制作用的影响因素

1）鱼源乳酸菌产酸强度与抑制作用的相关性。鱼源乳酸菌的产酸圈（图2、表2）：Y-6>Y-2>Y-11>Y-10>Y-7>Y-13，与抑菌圈呈正相关，说明鱼源乳酸菌产酸度越强，对嗜水气单胞菌抑制作用越大。

表2 鱼源乳酸菌产酸圈与抑菌圈 mm

2）嗜水气单胞菌浓度与抑制作用相关性。乳酸菌对不同浓度嗜水气单胞菌的抑制相关性结果见表3，嗜水气单胞菌的浓度越稀，抑菌圈越大。

表3 乳酸菌对C-1 不同稀释液的抑制试验 mm

3 讨 论

由鱼源乳酸菌体外抑菌试验结果得知：鱼源乳酸菌对嗜水气单胞菌有较强的抑制作用，这与孙梦桐等[6]、康绍珠等[7]的研究结果一致。由此可知，鱼源乳酸菌可用于嗜水气单胞菌的防治，其抑菌物质可能为乳酸菌产生的代谢产物——某蛋白类物质，如类抗生素物质、细菌素、类细菌素样物质或有机酸等，其抑菌机理可能为鱼源乳酸菌与嗜水气单胞菌在鱼类肠道竞争拮抗消化道黏膜附着点，从而抑制嗜水气单胞菌的生长。此外，乳酸菌产生的细菌素是一类选择性作用于细菌靶细胞的抗菌物质，可有效阻止细菌的增殖，抑制有害物质的产生，维持动物肠道健康，减少嗜水气单胞菌病的暴发。

本研究中，乳酸菌产酸度与嗜水气单胞菌的抑制作用呈正相关性，试验结果与辛娜等[8]、吴正可[9]研究结果基本一致，但有一定的差异，可能与平板的厚薄、干湿以及操作有关。由试验结果可知：乳酸菌的主要抑制因素与乳酸菌的数量、嗜水气单胞菌的接种量、培养基温度和pH 值等有关，其中影响抑制作用最重要的因素是细菌的种类及产酸强度。在临床实践的防治过程中，乳酸菌可在肠道内产生乳酸和醋酸，降低肠道pH 值，抑制嗜水气单胞菌的生长，因此，防治嗜水气单胞菌要选择生长迅速、产酸性强的菌株。

从本研究结果还可知，嗜水气单胞菌浓度与乳酸菌抑制作用呈负相关性，嗜水气单胞菌浓度越低，乳酸菌抑制作用越强。因此，防治嗜水气单胞菌关键在于菌液扩散的早期，临床上应以预防为主。同时，因乳酸菌可作用于改良水质、治疗疾病以及水产动物免疫疾病等方面，可在养殖水中定时定量添加乳酸菌，并定期消毒，从而使水体中乳酸菌的数量升高成为优势菌。这样不仅可通过竞争性抑制作用明显抑制养殖水体中的嗜水气单胞菌，而且还可通过直接的化学作用和间接的促进微生物的反硝化作用消除水体中的亚硝酸盐，起到净化水质的效果。

作为一种安全的益生菌，乳酸菌已经成为国际研究的热点。在养殖过程中将乳酸菌制剂部分替换抗生素作为饲料添加剂，有望解决抗生素残留和动物耐药性等问题，对水产养殖业的发展意义重大。实践证明，乳酸菌防治水生动物疾病是可行的。徐国辉等[10]证明乳酸菌对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、恶臭弧杆菌、鳗弧菌均有明显的抑制作用。目前，国内外对于鱼源乳酸菌对嗜水气单胞菌的抑制作用研究较少，本试验通过探寻乳酸菌对嗜水气单胞菌抑制作用及影响因素，可为乳酸菌对抑制嗜水气单胞菌的临床应用提供理论依据。