无创产前检测技术在胎儿性染色体非整倍体筛查中的应用价值▲

崖娇练 徐玉婵 许泽辉 蔡 稔 罗世强 蔡鹏飞 覃柳群 严提珍

(广西柳州市妇幼保健院医学遗传科、柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室、柳州市生殖医学重点实验室，广西柳州市 545001)

常见的性染色体非整倍体(sex chromosome aneuploidy,SCA)疾病包括特纳综合征、克氏综合征、47,XYY综合征及X三体综合征等。其中，47,XXX综合征及特纳综合征患者常表现为身材矮小、青春期发育延迟、卵巢发育不良、不孕、先天性心脏畸形等[1]。克氏综合征与男性睾丸发育不充分及不育症相关，相关表型通常在青春期后出现[2]。47,XYY综合征的表型多样且临床症状体征不明显，部分患者可无明显表型，而部分患者存在发育迟缓、学习困难、认知障碍等异常表现，并可能出现反社会倾向[3]。X三体综合征的患者表型高度可变[4]。

虽然有文献报告颈部水囊状淋巴管瘤及颈项透明层增厚与特纳综合征有关[5-6]，但对于其他类型SCA，目前没有准确率较高的产前筛查方法。因此，目前临床上多数特纳综合征患者可得到诊断，但克氏综合征、47,XYY综合征及X三体综合征等其他SCA的临床诊断较为困难；且克氏综合征的确诊年龄往往晚于特纳综合征、47,XXX及47,XYY综合征[7]，而未诊断及延迟诊断可导致患者错过最佳干预时机[8]。如何早期诊断SCA并及早干预，对SCA临床诊疗具有重要意义。无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)技术是一种通过对孕妇外周血游离DNA进行高通量测序及生物信息学分析，来评估胎儿染色体非整倍体发生风险的产前筛查技术。与传统的血清学筛查相比，NIPT技术具有高灵敏度和高特异性的特点，目前已被广泛应用于胎儿13-三体综合征、18-三体综合征及21-三体综合征的产前筛查，但其对胎儿SCA的检测效能仍缺乏研究数据。本研究采用NIPT技术对孕妇外周血游离DNA进行检测，探讨NIPT技术在胎儿SCA诊断中的临床应用价值，为胎儿SCA的诊断与尽早干预提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年8月至2020年12月期间，在我院行NIPT且结果提示SCA高风险的所有孕妇，共计223例。获得孕妇及家属知情同意后行侵入性产前诊断、孕妇外周血核型检查，并进行妊娠结局随访。入组时孕妇年龄为27.5～38.5(33.0±5.5)岁，孕周为14～20(17.0±3.1)周，其中初产妇45例(20.18%)、经产妇175例(78.48%)，有3例孕产史不详(1.35%)。

1.2 NIPT方法 使用DNA保存管采集孕妇的外周静脉血8～10 mL，轻柔颠倒混合使血液与采血管中的抗凝剂充分混合，室温放置30 min后于2 ℃～8 ℃条件下保存。样本无凝血、严重溶血等情况，且须在48 h内运达实验室，方视为合格样本。使用杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司生产的胎儿染色体非整倍体(T13/T18/T21)检测试剂盒(可逆末端终止测序法)(国械注准20153400461)，严格按照试剂盒说明书进行血浆游离DNA提取、末端补平、加接头、文库纯化、文库定量、文库混合、高通量测序(测序仪厂家：Illumina公司；型号：NextSeq CN500)及数据分析，使用贝瑞和康基因诊断技术有限公司的胎儿SCA数据分析软件(浙械注准 20182700231)对测序数据进行分析，异常结果由软件自动提示。

1.3 介入性产前诊断

1.3.1 样本采集：(1)羊水标本采集。 由具有从事产前诊断资质的临床医生在超声定位下对孕16～22+6周的孕妇行羊膜腔穿刺术，按8～10 mL/管抽取2管羊水送检。取样过程顺利，孕妇无术后并发症。(2)脐血标本采集。由具有从事产前诊断资质的临床医生在超声引导下对孕 23 周及以上的孕妇行脐静脉穿刺，抽取脐带血 2～5 mL,注入5 mL无菌肝素抗凝管送检。取样过程顺利，孕妇无术后并发症。

1.3.2 胎儿染色体核型分析：羊水和脐血样本分两线进行接种、培养，经制片、G显带后镜检。要求染色体分辨率达到320条带，每线至少计数10个核型，分析3个核型，如遇异常或有疑问的标本则需增加计数及分析的核型数。经根据国际人类细胞遗传学命名体系(ISCN2016)[9]对染色体核型进行描述。以该分析结果作为金标准，计算NIPT的阳性预测值(positive predictive value,PPV)，即NIPT检出的全部阳性例数中，真阳性(胎儿染色体核型分析最终确诊为SCA)例数所占的比例。

1.4 外周血染色体核型分析 抽取孕妇外周血静脉血2 mL(使用肝素抗凝剂)，按1.3.2的方法进行外周血染色体核型分析，但至少计数20个核型，分析5个核型。

2 结 果

2.1 NIPT结果 223例SCA孕妇中，检出X染色体减少的孕妇比例最高，其次是X染色体增加且有Y染色体、X染色体增加但无Y染色体的孕妇，检出Y染色体增加的孕妇比例最低。见表1。

表1 NIPT检出的性染色体异常情况

2.2 介入性产前诊断结果和妊娠结局 223例SCA高风险孕妇中，80.72%(180/223)的孕妇选择行侵入性产前诊断；16.14%(36/223)的孕妇拒绝行产前诊断；1.79%(4/223)的孕妇因超声异常而引产，未行产前诊断；1.35%(3/223)的孕妇自然流产。选择介入性产前诊断的180例孕妇中，有66例确诊为SCA，NIPT的总PPV为36.67%(66/180)，其在X染色体减少病例中的PPV最低，在Y染色体增加病例中的PPV最高，见表2；但在66例确诊为SCA的病例中，有8例NIPT结果提示的性染色体异常类型和介入性产前诊断的性染色体异常类型不符，见表3。在确诊的SCA孕妇中，终止妊娠率为57.58 %(38/66)，见表2。

表2 接受介入性产前诊断孕妇的诊断结果及妊娠结局

表3 NIPT筛查与介入性产前诊断类型不一致的情况

2.3 孕妇外周血核型分析结果 在接受介入性产前诊断的180例孕妇中，有47例同时进行了外周血核型检查，其中核型正常共36例，提示其他常染色体平衡易位或倒位共3例，性染色体异常共8例。这8例性染色体异常的病例中，NIPT结果有6例提示母源性异常，有2例未提示母源性异常；有3例的胎儿也经介入性产前诊断确诊为SCA，其他5例均为假阳性。见表4。

表4 8例外周血核型检查异常的病例情况

3 讨 论

3.1 NIPT对SCA的检出能力 本研究中，NIPT对SCA的总PPV为36.67%(66/180)，但在X染色体减少病例中的PPV仅为19.81%，而在X染色体增加且有Y染色体、X染色体增加但无Y染色体病例中的PPV均高于50%，在Y染色体增加中的PPV高达90.91%。由此可见，NIPT提示为性染色体三体的病例患SCA的概率更高，尤其是Y染色体增多病例，而NIPT用于X染色体减少的病例时PPV相对更低，这与国内外其他研究[10-11]结论一致。其原因可能为X染色体与Y染色体的高度同源及高通量测序读长短导致定位错误、GC偏倚[12-13]。虽然有研究显示NIPT在SCA产前筛查的PPV不如13三体综合征、18三体综合征及21三体综合征[10]，但张丽娜等[14]对242例性染色体异常胎儿的产前介入性前诊断指征分析表明，NIPT结果高风险已成为最常见的进行介入性产前诊断的指征，也是性染色体三体确诊最可靠的依据。我们的研究进一步证明了NIPT可以作为性染色体三体产前筛查的有效手段，且对胎儿SCA有一定的检出效能。

3.2 影响NIPT检测SCA结果准确性的因素 本研究中，有8例NIPT提示SCA高风险的孕妇经外周血核型分析存在性染色体异常，其中有3例经介入性产前诊断确诊，另外5例均为假阳性。NIPT技术在物理上并未将母源性游离DNA和胎源性游离DNA分离，母源性染色体畸变可以掩盖胎儿实际的染色体检测结果，故母源性染色体异常可能是引起NIPT假阳性的原因之一[15-17]。在NIPT中，相对于13三体综合征、18三体综合征及21三体综合征而言，母源性异常所致的SCA假阳性更常见[17]。因此，对于NIPT提示SCA高风险的假阳性病例，可通过对孕妇本人进行外周血染色体G显带核型分析或者染色体微阵列分析、全基因组拷贝数变异检测，分析导致假阳性的原因。对于真阳性的病例，孕妇的染色体核型分析也是必要的，可用于鉴别染色体畸变是遗传还是新发的，从而精准指导下一次生育。

此外，我们发现有8例样本NIPT提示的性染色体异常类型与介入性产前诊断结果不一致，其中5例孕妇进行了外周血G显带核型分析，均未发现异常。由于母体低比例的染色体嵌合可能无法通过外周血染色体核型分析检测明确，需要通过分辨率更高的染色体微阵列分析或全基因组拷贝数变异检测才能检测出来，因此我们无法确定这5个病例是否受母体X染色体低比例嵌合的干扰。陈雪娇等[18]报告了1例NIPT结果为45,XO高风险、胎儿核型为47,XXX[45]/46,XX[55]的嵌合体病例，胎盘荧光原位杂交技术检测提示80% 的45,XO嵌合。限制性胎盘嵌合也是影响NIPT结果准确性的主要原因之一[19]。本研究中，对于8例NIPT提示的性染色体异常类型与介入性产前诊断结果不一致的病例，均未能留取胎盘进行检测，不能排除胎盘嵌合引起的结果不一致。

除以上原因外，母血中胎儿DNA含量低、母亲罹患肿瘤、双胎之一停育等因素也是导致NIPT检测结果与介入性产前诊断结果不一致的生物学因素[19]。检测前尽可能完整地收集孕妇的临床资料，如孕产史、现病史、外周血染色体核型分析结果等，检测后多点留取胎盘样本，是分析导致NIPT假阴性或假阳性的原因的重要手段。

3.3 妊娠方式的选择 在66例确诊为SCA的病例中，有1例孕妇因宫颈机能不全而自然流产，38例(57.58%)孕妇自愿选择终止妊娠，以NIPT提示为X染色体减少和X染色体增加且有Y染色体的病例的终止妊娠率最高，分别为57.14%和82.61%。影响SCA病例终止妊娠的主要因素为SCA类型、超声结果异常，产前诊断为45,X和47,XXY的孕妇更倾向于选择引产[6]。有学者报告，低水平的45,X/46,XX嵌合现象可出现在表型正常的女性中，其寿命、生育能力及心血管功能等可能与正常人无明显的差异[20]。因此，确诊为X染色体减少的嵌合体病例是否应该引产，还应结合异常核型嵌合比例及超声检测结果谨慎地为孕妇提供咨询服务，以免过度解读报告带给孕妇巨大的心理压力。

总之，NIPT不仅在13三体综合征、18三体综合征及21三体综合征的产前诊断中发挥着重要的作用，对SCA的产前筛查也具有一定的价值，然而其在X染色体减少病例中的检测准确性仍有待提高。在胎儿SCA的遗传咨询及孕妇妊娠选择中，临床医师需要积累更多的数据，避免对报告过度解读。