矮身材儿童血清miR-125b表达水平和生长激素释放肽水平及其临床意义▲

陆 燕 覃小升 韦新艳

(来宾市兴宾区人民医院医学检验科，广西来宾市 546100)

矮身材为儿科内分泌门诊最常见的疾病之一，亦是近年来临床研究的一大热点。其病因机制复杂多样，不仅可引起儿童躯体异常，还可导致其自信心、自尊心、认知发育、社交能力等方面出现一定程度的问题，影响儿童的身心健康[1]。因此，早期全面、准确地对矮身材进行诊断，有助于及时纠正影响儿童生长的负面因素，尽早预防性用药，使儿童尽可能达到理想身高[2]。生长激素释放肽(growth hormone-releasing peptide,Ghrelin)是作用于全身各系统并调控腺垂体分泌生长激素的内源性配体，其不仅能够调控生长激素的分泌，亦能够维持能量平衡、刺激食欲、促进胃酸分泌和胃蠕动，对生长发育有重要作用[3]。有研究表明，miRNA参与人体生长发育过程[4]，其中miR-125b是miRNA家族中相当活跃的成员，目前已证实其在代谢、生长发育、调节免疫、细胞凋亡与增殖等方面均发挥着重要作用[5-6]。然而，miR-125b、Ghrelin水平对矮身材早期诊断价值的研究仍较少。因而，本课题组分析了矮身材儿童的血清miR-125b和Ghrelin水平，并探讨两者的临床意义，旨在为该病的临床诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2017年8月至2020年12月收治的103例矮身材儿童作为研究组，其中男童60例、女童43例，年龄为3～7(4.57±1.11)岁，入组时身高0.78～1.10(0.92±0.09)m。另选取同期在我院体检的100例健康儿童作为对照组，其中男童56例、女童44例，年龄为3～8(4.62±1.14)岁。两组儿童的年龄、性别差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。所有监护人均已了解本研究的大致流程及目的、内容、获益等，并签署知情同意书。

1.2 相关标准

1.2.1 矮身材的诊断标准：符合《矮身材儿童诊治指南》[7]中的相关标准，即在相似生活环境下，同种族、同性别和同年龄的儿童身高低于健康儿童第3百分位数以下或者2个标准差。

1.2.2 研究对象的纳入标准：(1)未伴有甲状腺功能衰退；(2)未合并遗传代谢病或基因异常，如特纳综合征等；(3)出生时体重正常；(4)近期无重症感染或急性创伤病史；(5)经血钙、血磷等检查证实无活动期佝偻病。

1.2.3 研究对象的排除标准：(1)情志、饮食生活习惯不良者；(2)身材比例不协调，疑似骨骼发育异常者；(3)存在代谢性疾病及其他慢性疾病引起的生长迟缓者；(4)入组前3个月内曾经接受过糖皮质激素、生长激素治疗者；(5)存在重要脏器疾病者。

1.3 一般资料的收集 收集并记录患儿入组时的年龄、性别、身高、体重，以及患儿父母的身高。计算体质指数和靶身高。体质指数=体重(kg)/身高2(m2)。靶身高计算公式：男童身高=[父亲身高(cm)+母亲身高(cm)+13 cm]÷2，女童身高=[父亲身高(cm)+母亲身高(cm)-13 cm]÷2。

1.4 治疗方法 所有矮身材患儿均接受生长激素治疗[8]，即给予重组人生长激素注射液(长春金赛药业有限责任公司，规格：30 IU/10 mg；批号：20170929；国药准字S20050025)0.15～0.20 IU/(kg·d)，每晚睡前半小时皮下注射，均连续治疗6个月。

1.5 骨龄测定 入组时拍摄左手正位+腕部X线片。根据X线片图像，运用《中国青少年儿童手腕骨成熟度及评价方法》[9]评估患儿的骨龄，并计算年龄与骨龄的差值，表示为年龄-骨龄。

1.6 实验室指标的检测

1.6.1 标本采集：研究组患儿于入院24 h内、治疗3个月和6个月后，对照组儿童于体检当日，抽取清晨空腹静脉血10 mL，分置两管，于室温保存。

1.6.2 实时荧光定量PCR检测血清miR-125b表达水平：取其中一管血液标本，采用TRIzolTM试剂[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：15596026)]提取标本血清RNA，微量核酸定量Qubit Flex 荧光计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]测定A260、A280值，并计算总RNA浓度，所提取的总RNA质量(A260/A280比值在1.8～2.2之间)和浓度(20 ng/μL以上)均符合PCR反应要求，随后于-80 ℃冻存，所有样本均于1个月内检测。按照反转录试剂盒(上海联迈生物工程有限公司，货号：LM-266)说明书，取2 μL RNA溶液进行反转录，获得cDNA模板。采用Primer软件设计引物，miR-125b上游引物序列为TCCCACGTGACGACGTCTAT，下游引物序列为TCGAGTCATGTTCACCGGACTG；U6(内参)上游引物序列为CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列为AACGCTTCACGAATTTGCGT。PCR反应体系共20 μL，包括Taq DNA聚合酶0.2 μL、Mg2+2.0 μL、模板DNA 0.2 μg、dNTPs 2 μL、引物0.5 μL，加双蒸水或三蒸水至20 μL。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共40个循环。在60 ℃时采集荧光信号，记录Ct值，以2-ΔΔCt法计算miR-125b的相对表达水平。为避免因各样本总RNA浓度的不同或是其他不可控因素导致的误差，同一条件检测3次，取其平均值。

1.6.3 ELISA检测血清Ghrelin水平：取另外一管血液标本，采用离心机低速离心(离心速度为3 500 r/mim，离心半径为8 cm，温度为4 ℃)20 min后获取血清，使用ELISA试剂盒(上海语纯生物科技有限公司，批号：20170712)检测血清Ghrelin水平。

1.7 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两独立样本t检验，重复测量计量资料的比较采用单因素重复测量方差分析；计数资料采用例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。使用Pearson检验进行相关分析性，使用Logistic回归模型分析血清学指标与儿童矮身材的相关性。以P<0.05为差异具统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平的比较 研究组治疗前的血清miR-125b表达水平及Ghrelin水平均高于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平比较(x±s)

2.2 血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平与儿童矮身材的相关性 以是否出现矮身材作为因变量，选取现研究认为可能与儿童矮身材相关的因素(靶身高、父亲身高、母亲身高、年龄-骨龄)、血清miR-125b表达水平、血清Ghrelin水平作为自变量，进行Logistic回归分析。变量赋值见表2。在校正相关因素后，血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平均与儿童矮身材相关(均P<0.05)，见表3。

表2 变量赋值表

表3 Logistic回归分析结果

2.3 矮身材儿童血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平与治疗效果的关系 矮身材儿童血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平均随着治疗时间的延长而降低(均P<0.05)，见表4。

表4 治疗前后矮身材儿童血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平的变化(x±s)

3 讨 论

目前疾病监测手段不断更新，更多的生物标志物应运而生。作为结构和功能较为明确的内源性配体，Ghrelin在人体生长发育中的作用得到诸多研究者的关注[10-11]。国外学者Maldonado-Ruiz等[12]通过一项动物实验发现，孕期母体营养过剩可出现Ghrelin高表达，而通过药物治疗抑制Ghrelin表达能够有效改善大鼠后代肥胖、贪食等表现及机体炎症水平。Yokota-Nakagi等[13]发现，通过下调Ghrelin及其受体的表达来抑制Ghrelin的促食欲作用，可缓解去卵巢肥胖大鼠的能量摄入紊乱和体重超标等情况。此外，有学者通过观察不同病因矮小症儿童在生长激素治疗前后的Ghrelin水平发现，矮小症患儿可能存在Ghrelin抵抗，血清Ghrelin水平有助于评估矮小症患儿治疗期间的生长情况[14]。近年来国内外的最新临床试验研究[15-16]同样也支持这一结果。本研究结果显示，矮身材儿童治疗前的血清Ghrelin水平高于健康儿童，且Logistic回归分析结果提示血清Ghrelin水平升高与儿童矮身材相关(P<0.05)，与解欣等[17]的研究相似。Ghrelin不仅可通过不同的方式调控生长激素-胰岛素轴，还能够调节成骨细胞的分化和功能，诱导骨髓干细胞的增殖及分化，进一步调节骨骼代谢与机体能量代谢，从而影响骨骼的生长状态，因此推测抑制Ghrelin活化可调节体内能量平衡、调控骨发育等[18]。由此可见，矮身材儿童体内Ghrelin呈反馈性增高，从而在促进生长发育中起重要作用。

人的生长和最终身高亦受到遗传因素的影响，而表观遗传调控机制涉及DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA[19]。miRNA是一种高度保守的、长度约为22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，其主要通过与靶mRNA的3′非翻译区结合，以激活下游的靶因子，从而调控细胞的病理过程[20]。miRNA参与多个生命过程，其中miR-125b在内分泌疾病的发生、发展中所发挥的作用已逐渐得到关注。唐家彦等[21]发现，中枢性性早熟女童的血清miR-125b表达水平升高，是下丘脑-垂体-性腺轴过早激活的可能作用机制。此外，郭东光等[22]发现，miR-125b与细胞的生长、分化和发育功能相关，而Ghrelin可通过调节miRNA的表达影响3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化；这一发现亦证实了细胞增殖分化过程中Ghrelin与miR-125b存在反馈调节机制，后者可能是调节生长发育的重要潜在靶基因。本研究结果显示，矮身材儿童血清miR-125b表达水平高于健康儿童，且Logistic回归分析结果提示血清miR-125b表达水平升高与儿童矮身材相关(P<0.05)，这符合矮身材的发生和进展机制，表明miR-125b参与矮身材儿童的生长发育。

进一步分析发现，随着治疗时间的延长，血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平均降低(P<0.05)，即随着治疗药物起效，矮身材儿童的生长发育趋于正常后，其体内的miR-125b表达水平和Ghrelin水平也随之下调。这也间接表明，监测血清miR-125b和Ghrelin水平有助于判断病情的发展和预后，从而及时调整矮身材儿童的治疗方案。

综上所述，矮身材儿童血清miR-125b表达水平和Ghrelin水平均升高，两者在促进矮身材儿童生长发育过程中起着重要作用，且有助于评估矮身材儿童的治疗效果。但本研究样本量相对较小，这可能对结果可信度造成一定影响。因此今后仍需开展大样本、多中心的临床研究对本研究结果进行进一步论证。