咖啡酸螯合锌的体外生物活性研究

任 伟 ， 尹 君 ， 范俊兵 ， 任宏振 ， 苏振尧

(1.河南省科研平台服务中心 ， 河南 郑州 450000 ； 2.尉氏县职业技术教育中心 ， 河南 尉氏 475500 ； 3.华南农业大学 动物科技学院 ， 广东 广州 510642)

我国是畜牧业生产和消费大国，抗生素在促进生长和预防疾病方面效果突出，已被广泛应用于畜牧业。然而，抗生素在动物饲料中的过度使用造成了严重的环境和健康风险，影响了动物和人类健康、食品安全、生态系统以及畜牧业的可持续发展[1-2]。2020年7月饲料端开始全面禁用抗生素，很多科研工作者和企业在积极探索有效的替代产品，来满足禁用抗生素后对畜牧业生产和健康的影响。

硫酸锌(ZnSO4)长期以来被用作饲料中的主要营养源，但利用率低，需要大量添加；而有机锌源的生物利用度相对高于无机锌源，可降低饲料中锌的添加浓度[3-5]。咖啡酸是一种从五味子根茎中分离的白色针状酚羟基类有机酸，有潜在的药用价值，具有多种生物和药理活性，如抗炎、镇痛、抗菌和神经保护作用[6-8]。该研究通过评价咖啡酸螯合锌的体外生物活性，为提高锌的有效利用率和开发理想替抗产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1药品、试剂及耗材

咖啡酸螯合锌，斯卡恩动物保健品(商丘)有限公司；硫酸锌、氢氧化钠、盐酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；人工胃液、人工肠液，上海信帆生物科技有限公司；透析袋(3.5 kDa)，苏州达麦迪生物医学科技有限公司；96孔培养板，贝兰伯生物技术(杭州)有限公司；EMB固体培养基以及LB 液体、固体培养基，山东拓普生物工程有限公司。

1.1.2仪器设备

超声波清洗器，上海菁华科技仪器有限公司；高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；无菌超净台、单人单面净化工作台、水浴恒温振荡器，江苏金坛市振兴仪器厂；台式微量高速离心机，长沙湘仪离心机有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1体外消化吸收率测定

1.2.1.1体外模拟胃消化

分别称取含有效锌离子1 000 mg的咖啡酸螯合锌和硫酸锌，用100 mL蒸馏水完全溶解，配制成含锌离子浓度为10 g/L的咖啡酸螯合锌溶液和硫酸锌溶液；用浓度为1 mol/L 的盐酸溶液将上述两种溶液的pH 值调至2.0；准确量取5 mL模拟人工胃液，加入上述两种溶液中，置于37 ℃水浴中振荡 2 h，结束后，再将上述两种溶液置于 100 ℃ 水浴中 10 min 对消化酶灭活，即模拟的胃消化液。

1.2.1.2体外模拟肠吸收

取1.2.1.1制备的模拟胃消化液，用浓度0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节胃消化液pH值至7.0，再向溶液中加入5 mL模拟人工肠液，混合均匀；将混合均匀的溶液装入透析袋(3.5 kDa)，置于37 ℃水浴中振荡 2 h，结束后，将溶液置于100 ℃水浴中10 min对消化酶灭活。

1.2.1.3锌离子吸收率的测定

取1.2.1.1、1.2.1.2中制备的含有咖啡酸螯合锌溶液或硫酸锌溶液的模拟胃消化液和模拟肠消化液各20 mL，15 000 r/min离心10 min，测定3个重复。按照《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》(GB/T 13885—2017 )中锌含量测定方法，分别测定上清液中锌离子的含量和1.2.1.1中咖啡酸螯合锌溶液、硫酸锌溶液中锌离子的含量。按照公式(1)计算锌离子溶解率。

(1)

式中：c1为上清液中锌离子的浓度，g/L，c2为咖啡酸锌溶液、硫酸锌溶液中锌离子的浓度，g/L。

1.2.1.4锌离子透过率的测定

测定模拟肠吸收的溶液经过透析袋后溶液中锌离子的含量，3次重复，测定锌离子的透过率。按照公式(2)计算锌离子透过率。

(2)

式中：c1为透析袋外锌离子的浓度，g/L，c2为模拟肠吸收的溶液中锌离子的浓度，g/L。

1.2.2体外抑菌试验

1.2.2.1菌株分离

采集新鲜的鸡粪、猪粪，用浓度为0.85%的生理盐水50倍稀释，量取稀释液0.1 mL，涂布到EMB固体培养基平板；37 ℃恒温培养24 h，观察固体培养基平板上菌落的形态；用接种针挑取单个菌落接种斜面培养基上37 ℃培养24 h，分别鉴定筛选猪源大肠杆菌、鸡源大肠杆菌、猪源沙门菌和鸡源沙门菌各5株备用。

1.2.2.2菌悬液的制备

从1.2.2.1中分离的4种细菌中，每种各随机选取1株在斜面培养基上保存备用的单个菌落，接种于10 mL LB液体培养基中37 ℃培养6～8 h，取20 μL菌液入5 mL肉汤培养基，摇匀备用，此时菌液浓度为1×1011～2×1011CFU/L。使用前作1 000倍稀释，此时菌液浓度为1×108～2×108CFU/mL。

1.2.2.3抑菌液的制备

取2个灭菌过的100 mL容量瓶，再分别称取0.102 4 g(有效含量以咖啡酸计)的咖啡酸螯合锌、咖啡酸于容量瓶中，每个容量瓶中加入50 mL灭菌蒸馏水溶解完全，混匀，再用灭菌蒸馏水定容至100 mL，作为浓度为1 024 mg/L的储备液置于冰箱中4 ℃保存备用，即为抑菌液。

1.2.2.4抑菌试验

取灭菌处理后的96孔培养板，用移液枪量取100 μL LB液体培养基加入第1排第1孔到第12孔；再量取100 μL 抑菌液，加入第1排第1孔中混匀，从第 1孔吸 100 μL抑菌液加入第2孔混匀，从第2孔吸100 μL抑菌液加入第3孔混匀；依次稀释至第10孔，并从第10孔吸取100 μL 弃去。此时各孔的抑菌液浓度依次为：512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L。稀释完成后，每孔加入浓度为108CFU/L的菌悬液100 μL ，第11孔是菌液不加抑菌液的阳性对照孔，第12孔是加抑菌液不加菌液的阴性对照孔。将96孔板在培养箱中30 ℃培养48 h，观察孔内液体是否透明， 以肉眼观察的无细菌生长(透明)孔对应的抑菌液浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。

1.3 数据处理

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行t检验，“平均值±标准误”的形式表示，P<0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 体外消化吸收率测定结果

咖啡酸螯合锌在模拟体外胃肠道环境条件下消化吸收率的测定结果见表1。咖啡酸螯合锌在模拟胃、肠环境下的锌离子吸收率显著(P<0.05)高于硫酸锌；在模拟肠吸收的溶液经过透析袋后，溶液中的锌离子透过率显著(P<0.05)高于硫酸锌。

胃的消化是在酸性(pH值<4.0)环境下进行的，特定的酸性环境有利于金属离子的释放和吸收，因此，咖啡酸螯合锌和硫酸锌模拟胃环境下的锌离子都表现出较好的吸收率[16]。肠的消化是在碱性环境条件下进行的，无机锌容易形成不溶性的金属络合物，影响金属离子的吸收和利用，因此，在咖啡酸螯合锌在模拟肠环境下锌离子的吸收率和透过率都高于硫酸锌[17]。

表1 体外消化吸收率测定结果 %

2.2 体外抑菌试验MIC测定结果

咖啡酸和咖啡酸螯合锌的体外抑菌试验结果见图1和表2。咖啡酸对猪源大肠杆菌MIC值为64 mg/L，禽源大肠杆菌MIC值为64 mg/L，猪源沙门菌MIC值为128 mg/L，禽源沙门菌MIC值为64 mg/L；咖啡酸螯合锌对猪源大肠杆菌MIC值为32 mg/L，禽源大肠杆菌MIC值为16 mg/L，猪源沙门菌MIC值为64 mg/L，禽源沙门菌MIC值为16 mg/L。

图1 咖啡酸和咖啡酸螯合锌体外抑菌试验MIC值比较

表2 咖啡酸和咖啡酸螯合锌体外抑菌试验MIC测定结果

图1可以看出，咖啡酸螯合锌对猪源大肠杆菌、沙门菌的体外抑菌MIC值均低于咖啡酸；咖啡酸螯合锌对猪源大肠杆菌的MIC值低于猪源沙门菌，对禽源大肠杆菌和禽源沙门菌的MIC值相同；咖啡酸螯合锌对禽源大肠杆菌的MIC值低于猪源大肠杆菌，对禽源沙门菌的MIC值低于猪源沙门菌，可见咖啡酸螯合锌对不同动物来源的病原菌MIC值有一定差异。

3 结论

据观察，蛋氨酸锌(Zn-Met)中锌的生物利用度为228%，相对于硫酸锌(ZnSO4)(100%)，而氧化锌的生物利用度仅为61%[11]。

本研究咖啡酸螯合锌在模拟胃环境下的锌离子溶解率为(92.46±1.23)%，优于硫酸锌；而在模拟肠环境下的咖啡酸螯合锌溶解率为(67.68±1.92)%，与硫酸锌相比增加77.12%；而咖啡酸螯合锌透过率为(36.32±1.18)%，与硫酸锌相比增加108.18%，可见咖啡酸螯合锌的生物利用度高于硫酸锌。

咖啡酸螯合锌是由咖啡酸上的酚羟基与锌离子形成配位键，增加了咖啡酸与锌离子之间的稳定性，在胃肠环境条件下不易受胃的酸性环境、肠道的碱性环境的破坏，因此在胃肠环境条件下咖啡酸螯合锌在吸收率和透过率表现出明显的优势。咖啡酸螯合锌以分子状态更容易穿透肠道屏障进入血液循环，表现出很强的生物利用度。

咖啡酸是富含羟基肉桂酸的一种重要天然衍生物，咖啡酸通过羧酸基团与锌离子螯合，会影响配体的生物学特性，包括抗氧化和抗菌活性。咖啡酸螯合锌对大肠杆菌、沙氏菌的体外抑菌的MIC值明显优于咖啡酸的MIC值，可能跟脂溶性有关。

咖啡酸螯合锌中锌离子的利用率高和抑菌活性强，为一种新型的锌源和替抗产品的研究提供了实验室基础。