柑橘GGP基因家族生物信息学分析

王平，柯甫志，徐建国

(浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318026)

抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)是一类重要的次生代谢产物，其主要作用是作为抗氧化剂和辅酶因子参与氧化还原反应，同时参与表观遗传激活[1-2]。AsA是人体必需的营养物质，人体自身无法合成，主要从果蔬中摄取。柑橘品种资源丰富，鲜果供应时间长，可满足周年供应，已成为我国最大、全球第二大的消费水果，是人们日常生活获取AsA的重要来源[3]。

植物中存在4条AsA生物合成途径，拟南芥、番茄等植物突变体结果表明，L-半乳糖途径是主导途径[4-6]。GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphorylase，GGP)，又名GDP-L-半乳糖转移酶(GDP-L-galactose transferase，GGT)，催化GDP-L-半乳糖和L-半乳糖-1-磷酸之间的转化，被认为是AsA生物合成途径中的重要控制节点[7-9]。

GGP基因家族的全基因组鉴定与特点分析已在小麦中报道[10]。截至目前，GGP基因功能在柑橘中的研究仅局限于单个成员研究[3,11]，整个GGP基因家族的生物信息学分析还未见报道。本文通过柑橘已公布的全基因组信息和转录组数据，分析柑橘GGP蛋白质理化性质、二级结构、启动子顺式作用元件和转录组表达，为进一步确定柑橘GGP家族基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 染色体定位和序列分析

GGP基因家族序列、染色体定位信息来源于Phytozome数据库。

1.2 蛋白质理化性质分析和亚细胞定位

蛋白质理化性质分析采用在线软件(https://web.expasy.org/protparam/)进行。亚细胞定位分析采用在线软件(http://cello.life.nctu.edu.tw/)进行。

1.3 蛋白质二级结构分析

采用在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白质二级结构。

1.4 顺式作用元件分析

从NCBI数据库里获取克里曼丁橘GGP基因家族编码序列起始位点上游2 000 bp的序列，采用PlantCARE软件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)分析启动子区域顺式作用元件，预测基因功能。

1.5 转录组数据分析

柑橘GGP基因家族的转录组数据来自http://citrus.hzau.edu.cn在线数据库。

2 结果与分析

2.1 柑橘GGP基因家族染色体定位和序列分析

从Phytozome数据库公布的克里曼丁橘全基因组中鉴定到4个GGP家族成员，分别命名为CsGGP1～CsGGP4。通过染色体定位发现，CsGGP1、CsGGP2、CsGGP3和CsGGP4分别位于9号、1号、6号和2号染色体上，除了CsGGP1外，其他3个成员都是全长基因；4个成员的序列长度介于921～1 368 bp，内含子数4～6个(表1)。

表1 柑橘GGP基因家族染色体定位和序列分析

2.2 柑橘GGP基因家族蛋白信息

4个基因家族序列通过Expasy在线软件分析，蛋白质氨基酸个数在307～455个，相对分子量在35 021 440～50 540 620，等电点在 5.03～6.87；4 个成员均为不稳定蛋白质，不稳定指数在 41.35～53.20；脂溶指数89.14～96.19；4个家族成员的疏水性稍有差异，除CsGGP4为正值外，其他3个成员均为负值(表2)。

表2 柑橘GGP基因家族理化性质和亚细胞定位

亚细胞定位结果显示，柑橘GGP 4个家族成员存在差异，CsGGP1分布于细胞核，CsGGP2和CsGGP3位于细胞质，而CsGGP4分布于细胞膜。

蛋白质二级结构分析得出柑橘GGP基因家族主要的二级结构是无规则卷曲和α-螺旋，分别占39%以上和33%以上；其次是延伸链，占16%以上；最后是β-转角，占5%左右(表3)。

表3 柑橘GGP基因家族蛋白二级结构分析

2.3 柑橘GGP基因家族顺式作用元件分析

对柑橘 GGP基因家族启动子区上游2 000 bp的序列进行顺式作用元件分析，结果如表4显示，4个家族成员的启动子区域均含有与光响应、脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件，其中光响应元件个数最多，最高达到20个；不同成员还具有水杨酸、赤霉素和生长素等其他激素信号传导、逆境胁迫(厌氧、低温等)与植物生长发育等结合位点。

表4 柑橘GGP基因家族顺式作用元件分析

2.4 柑橘GGP基因家族转录组分析

柑橘4个GGP基因家族成员在组织特异性、果皮发育和黄龙病(Huanglongbing，HLB)胁迫中表现不同(图1和图2)。4个成员中，CsGGP2在胚珠、果肉、叶片和须根等被测样品中均高表达，尤其在果肉中，但在须根中的表达量显著低于其他组织，不到果肉的1/10；CsGGP4成员在胚珠、叶片和须根中表达较高，尤其在须根中与CsGGP2表达量相当；CsGGP1和CsGGP3在被测样品表达量均很低。随着果皮发育，CsGGP2表达量呈现下降趋势。须根HLB感染后，CsGGP2和CsGGP4表达量均增加。

图2 柑橘4个GGP家族成员不同组织和HLB感染后的转录组表达

3 讨论

本研究在克里曼丁橘全基因组范围鉴定出 GGP 家族 4个成员，分别位于4条不同染色体上，亚细胞定位分布于细胞核、细胞质和细胞膜中。启动子顺式作用元件预测4个柑橘GGP基因家族成员均含有大量光响应相关的作用元件，尤其是CsGGP2和CsGGP4。研究显示，AsA作为电子载体或供体参与光合作用[12-13]，且L-半乳糖生物合成途径与光合作用紧密相关[1]；拟南芥AsA合成量和GGP表达均受高光逆境诱导[4,14]，这些结果均表明，GGP基因家族涉及光响应。

转录组分析数据显示，CsGGP2成员表达量在被测组织均最高，表明CsGGP2是L-半乳糖生物合成途径中的主导成员；CsGGP2在果皮发育过程中呈现下降趋势，猜测CsGGP2参与柑橘果皮早期发育，这与L-半乳糖生物合成途径被认为在叶片、绿果等绿色组织中起主要作用的研究结果一致[3-4,15]。须根感染黄龙病后，CsGGP2和CsGGP4表达均增加，表明CsGGP2和CsGGP4参与黄龙病逆境胁迫。