健脾调肠汤对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠NLRP6、NLRP3信号通路的影响

王延秋，郭 星，庞晨欢，袁子云，刘海涛，杜晓泉

(1. 陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712000；2. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

溃疡性结肠炎是一种以反复腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要临床表现的慢性非特异性炎症性肠病，具有病情易反复、难治愈特点，是消化系统难治疾病之一[1]。其发病与遗传、免疫、肠道菌群、环境因素密切相关，其中免疫调节失常贯穿该病发生发展的整个过程[2]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)家族作为一类模式识别受体，参与机体固有免疫，其中NLRP3和NLRP6是NLRs家族中与炎症性肠病发生发展联系最为密切的两种炎症小体[3]。当遭受炎症或病原体刺激后，机体会启动先天免疫应答，上调NLRP3的表达，释放白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)等炎症因子，导致肠黏膜屏障受损；而NLPR6在被激活时，可通过调控白细胞介素-22(IL-22)的表达而促进肠上皮occludin蛋白[4]和黏蛋白的分泌[5]，从而修复受损的肠黏膜。健脾调肠汤是杜晓泉教授在长期实践中总结的治疗溃疡性结肠炎的有效经验方，临床研究证实该方可显著改善溃疡性结肠炎患者的临床症状[6]；动物研究证实该方可通过抑制核因子-κB(NF-κB)活化，改善2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜病理改变，促进大鼠结肠溃疡愈合[7]。本研究旨在通过观察健脾调肠汤对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠炎症因子及肠黏膜NLRP6、NLRP3、occludin蛋白表达的影响，进一步探讨健脾调肠汤对溃疡性结肠炎小鼠的肠黏膜修复机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级BALB/c雄性小鼠60只，8周龄，体重(20±2)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(陕)2018-001。小鼠饲养于陕西中医药大学医学科研实验中心动物房，12h光照和黑暗循环，室内温度(23±2)℃，空气相对湿度40%～55%。本实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会审批通过(2020010)。

1.2药物 健脾调肠汤由党参15 g、白术15 g、薏苡仁15 g、败酱草15 g、黄连3 g、陈皮12 g、厚朴12 g、血竭5 g组成，药材购于陕西中医药大学附属医院中药房。精确称取上述药物，凉水浸渍30 min，煎煮2次，每次30 min，4层纱布过滤，合并滤液水浴蒸发制成1 g/mL生药的水煎液，高温灭菌，冰箱4 ℃保存待用。柳氮磺吡啶肠溶片(上海信谊天平药业有限公司，国药准字H31020557，批号：09201103，规格：0.25 g)，取适量片剂研磨成粉，然后溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.02 g/mL混悬液，低温封存备用。

1.3试剂与仪器 DSS(美国MP公司，货号：HY-17027)；小鼠IL-1β、IL-18、IL-22 ELISA试剂盒(联科生物，货号：EK0201B/3，EK218-48，EK222/2-48)；山羊抗兔NLRP6 抗体、山羊抗兔 β-肌动蛋白(β-actin)抗体(武汉爱博泰克生物科技公司，货号：A15628，BM0627)；山羊抗兔NLRP3抗体、山羊抗兔OCLN抗体(武汉博士德生物有限公司，货号：BA3677，BM4832)；HRP-羊抗兔、HRP-羊抗小鼠(武汉博士德生物有限公司，货号：BA1054，BA1050)。高速冷冻离心机(日本日立CR22G Ⅱ)、研究级正置数码显微镜(Zeiss A1及A2)、电泳仪(北京六一)、转膜仪(上海天能)、电子精密天平(赛多利斯)、石蜡切片机(德国徕卡)、匀浆器(宁波新芝)。

1.4实验方法 60只小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组及健脾调肠汤高、中、低剂量组，每组10只。正常组自由饮水进食；其余各组小鼠连续7 d自由饮用3% DSS溶液，接着连续7 d自由饮水，重复2个循环后，随机选取3只小鼠取结肠组织，行HE染色观察溃疡性结肠炎模型是否造模成功。证实造模成功后，从第29天开始，健脾调肠汤高、中、低剂量组分别给予27.64 g/kg、13.82 g/kg、6.91 g/kg健脾调肠汤灌胃(按体表面积法[8]计算给药剂量)，柳氮磺吡啶组给予0.45 g/kg柳氮磺吡啶溶液灌胃；正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均每日1次，连续灌胃14 d，动物饲养期间自由饮食及饮水。每天观察小鼠的一般情况变化，如精神状况、活动情况、毛色、体重、饮食饮水量、大便状况。

1.5标本采集 药物干预结束，小鼠禁食24 h，用5%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉小鼠后，摘眼球取血，采血后处死小鼠，剪取全结肠，在结肠病变处截取1 cm，置于4%多聚甲醛溶液固定，剩余结肠组织冻存管分装，-80 ℃冰箱保存。

1.6观测指标及方法

1.6.1小鼠一般情况及体重、疾病活动指数(DAI)每天观察小鼠活动度及粪便形状和隐血情况，测量体重，并根据以下评分量表(见表1)计算 DAI，DAI=(体重减轻百分比评分+粪便性状评分+隐血或血便评分)/3。

1.6.2血清IL-1β、IL-18、IL-22水平 根据ELISA试剂盒的相关说明检测血清IL-1β、IL-18、IL-22水平。

1.6.3结肠组织病理学观察 各组小鼠结肠组织多聚甲醛固定后脱水、包埋、切片、HE染色，观察结肠组织病理损伤况。

表1 疾病活动指数评分量表

1.6.4结肠组织中NLRP6、NLRP3、Occludin蛋白表达情况 采用Western blot法检测：提取结肠组织蛋白，BCA法测定蛋白含量。根据待检测蛋白相对分子质量，用合适浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离(浓缩胶电压为80 V，待蛋白样品电泳至下层分离胶时调为100 V恒定电流，条带跑至底部时停止)，随后电转(150 mA，80 min) 至PVDF 膜上。用TBST洗膜5～10 min×3次，用脱脂奶粉封闭2 h，封闭完的PVDF膜用TBST清洗1遍后置于一抗中，置于4 ℃冰箱缓慢摇动过夜。次日，TBST洗膜后加入二抗(HRP-羊抗兔1∶5 000，HRP-羊抗小鼠1∶5 000)室温孵育1 h；TBST洗膜，加ECL工作液，吸干发光液，置印迹膜于成像分析仪自动成像，应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况及体重、DAI评分变化 造模前各组小鼠活泼好动、毛色光亮、反应灵敏。造模期间，除正常组外，其余各组小鼠造模约3 d后大便变稀，无肉眼血便，部分小鼠出现大便隐血阳性；造模第7天，各组小鼠出现肉眼血便，精神萎靡，懒动迟钝，毛色晦暗，体重下降，DAI评分均明显高于正常组(P均<0.05)；饮用蒸馏水第3天开始小鼠大便逐渐成形，体重增加，活动度增加；循环第二周期结束时小鼠体重增加幅度小于第一周期结束时，其体重变化与DSS干预呈动态变化。各给药组小鼠给药期间体重随时间的变化逐渐增加，各时间点均明显高于模型组(P均<0.05)，且健脾调肠汤高剂量组、柳氮磺吡啶组变化更为明显(P均<0.05)；除正常组外，其余各组小鼠的DAI评分均明显低于同期模型组(P均<0.05)。见图1。

图1 正常组和溃疡性结肠炎各组小鼠体重及DAI评分变化

2.2各组小鼠血清IL-1β、IL-18 和IL-22水平比较 与正常组比较，模型组小鼠血清IL-1β、IL-18水平均明显升高(P均<0.05)，血清IL-22水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，柳氮磺吡啶组和健脾调肠汤高剂量组血清IL-1β、IL-18水平均明显降低(P均<0.05)，健脾调肠汤各组及柳氮磺吡啶组血清IL-22水平均明显升高(P均<0.05)，健脾调肠汤中、低剂量组血清IL-1β、IL-18水平变化不明显(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和溃疡性结肠炎各组小鼠血清IL-1β、IL-18和IL-22水平比较

2.3各组小鼠结肠组织病理表现 正常组小鼠结肠组织黏膜上皮结构完整，固有层腺体排布规整，杯状细胞数量正常；模型组小鼠结肠组织黏膜上皮缺损，腺体出现分支且不规则，隐窝萎缩变形，排布杂乱，杯状细胞变少，可见慢性炎症细胞浸润；与模型组比较，柳氮磺吡啶组及健脾调肠汤各组可见上皮结构缺损程度、腺体紊乱程度及炎性细胞浸润程度有所减轻，隐窝结构改变有所缓解，其中柳氮磺吡啶组及健脾调肠汤高剂量组改善更为明显。见图2。

图2 正常组和溃疡性结肠炎各组小鼠结肠黏膜HE染色表现(×100)

2.4各组小鼠结肠组织中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白表达情况 与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中NLRP6、occludin蛋白相对表达量明显降低(P均<0.05)，NLRP3蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)；与模型组和健脾调肠汤低剂量组比较，健脾调肠汤高、中剂量组及柳氮磺吡啶组小鼠结肠组织中NLRP6、occludin蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05)，NLRP3蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)，健脾调肠汤高剂量组、健脾调肠汤中剂量组及柳氮磺吡啶组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3和表3。

1为柳氮磺吡啶组；2为健脾调肠汤高剂量组；3为健脾调肠汤中剂量组；4为健脾调肠汤低剂量组；5为模型组；6为正常组图3 正常组和溃疡性结肠炎各组小鼠结肠组织中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白表达情况

表3 正常组和溃疡性结肠炎各组小鼠结肠组织中NLRP3、NLRP6、occludin蛋白相对表达量比较

3 讨 论

溃疡性结肠炎病变主要累及结肠黏膜和黏膜下层，肠黏膜屏障功能受损是其发生的主要病理学基础[9]。溃疡性结肠炎的反复发作与多因素作用有关，其中免疫异常是主要影响因素[10]。当肠道的免疫系统发生异常，可导致大量炎症因子释放，从而引起肠上皮细胞坏死、脱落，肠黏膜的自我修复能力受限，使病情反复发作。

NLRs是一大类炎症蛋白，可同时感知病原体相关的分子模式(PAMPs)和损伤相关的分子模式(DAMPs)，并通过招募凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1或11(Caspase-1或11)形成炎症复合物，参与免疫应答[11]。NLRP3蛋白激活后能促进NLPR3炎症小体的组装，之后促进大量有活性的IL-1β和IL-18释放，加重肠道的炎性损伤[12]；NLRP6高度表达于肠道组织中，其严格调控作用是维持肠道内环境稳态的关键[13]，近期研究表明NLRP6在调节肠道微生物群、维持上皮屏障完整性、促进肠道上皮损伤的愈合和抑制肠上皮的异常增殖方面起着重要作用[14]。在溃疡性结肠炎的免疫反应中，NLRP6被激活，并通过调控IL-18以促进IL-22结合蛋白分泌，竞争IL-22的结合位点，提高IL-22含量，IL-22可以促进肠道上皮细胞分泌黏蛋白、抗菌肽以增强肠道固有免疫反应，并刺激肠道内质网发生应激反应以增强肠道上皮屏障功能[15]。在溃疡性结肠炎缓解期，适当的IL-22分泌可以上调肠黏膜中occludin表达，促进上皮细胞增殖修复，维持肠道屏障结构的完整性[16]，从而增强肠道屏障功能。

溃疡性结肠炎属中医“久痢”“泄泻”范畴，脾虚湿滞、血壅肠腑是其主要病机，临床上常用健脾理气、清热利湿、解毒排脓之法治之。健脾调肠汤组方中党参益气健脾，败酱草清热解毒、排脓化瘀，二者共为君药；白术健脾利水，黄连清热燥湿、厚肠胃，薏苡仁健脾利湿、清热排脓，共为臣药；佐使药陈皮、厚朴理气燥湿，血竭化瘀活血止血、生肌敛疮、消肿止痛，且血竭能抑制血栓形成，改善肠道局部血液循环，促进创面愈合[17]。全方具备健脾祛湿、养血消壅之功效。

本实验采用3% DSS溶液与蒸馏水交替喂养小鼠构建溃疡性结肠炎模型，该模型的病理改变及病程变化能更准确地模拟人类溃疡性结肠炎的特点[18]，适用于研究溃疡性结肠炎药物潜在靶点。本研究发现，造模后小鼠出现体重下降、精神萎靡、稀水样便、血便等，且这些症状随着DSS与蒸馏水交替而呈动态变化，在DSS结束时小鼠体重下降最明显，DAI评分最高，而开始给予蒸馏水时，小鼠体重下降停止，缓慢增加，DAI评分逐渐下降，这与临床上溃疡性结肠炎患者症状反复相似。给予药物干预后，各给药组小鼠体重逐渐恢复，一般状态好转，结肠组织病理情况改善；与模型组比较，健脾调肠汤高剂量组血清IL-18、IL-1β水平和健脾调肠汤高、中剂量组结肠组织中NLRP3蛋白相对表达量明显降低，健脾调肠汤各剂量组血清IL-22水平和健脾调肠汤高、中剂量组结肠组织中NLRP6、occludin蛋白相对表达量均明显增高。

本实验结果提示，健脾调肠汤可能通过影响NLRP3、NLRP6蛋白表达以抑制IL-18、IL-1β释放，减轻溃疡性结肠炎小鼠肠道的炎症损伤；通过分泌IL-22而上调occludin表达，以促进肠上皮细胞增殖，影响溃疡性结肠炎小鼠的肠黏膜修复。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。