一贯煎对慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠甲状腺功能和TGF-β1/Smad通路的影响

林宗粤，程宇星，吴剑纯，吴漪彤，王佳乐

(1. 广州中医药大学，广东 广州 510145；2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510000；3. 广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510080)

胃癌是我国发病率和病死率最高的消化道恶性肿瘤，也是世界范围内肿瘤相关死亡的第二大原因，病死率仅次于肺癌，严重威胁着人们的生命健康[1]。慢性萎缩性胃炎(CAG)是胃癌病理进展中重要的一环，以胃黏膜腺体萎缩和不典型增生为特征，临床以上腹胀痛及消化不良为主要表现[2]。其病程较长，难以治愈且易于恶变，现代医学仍缺乏公认的有效治疗手段。近年来，中医药在CAG等慢性胃病中的作用逐渐受到关注，中药复方在改善CAG患者症状及逆转CAG进程方面显示出明显优势[3]。中医将CAG归于“胃萎”“痞满”等范畴，多认为该病以胃阴不足、肝郁气滞为病机特点，治宜养阴疏肝、理气和胃。一贯煎为疏肝滋阴首选方，可有效缓解CAG患者临床症状[4]，然而关于其具体作用机制的研究报道较少。Lahner等[5]研究报道，CAG的发病与下丘脑-垂体-甲状腺轴功能异常密切相关，患者血循环中甲状腺激素含量降低。李玉凤等[6]报道，转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路的异常激活在CAG发病过程中发挥着重要作用，通过抑制其活化可有效阻断病情进展。本实验通过建立CAG癌前病变大鼠模型，探讨了不同剂量一贯煎对甲状腺激素水平及TGF-β1/Smad信号通路的影响，旨在为其防治CAG提供实验理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重(160±20)g，由广州中医药大学提供，动物合格证号：SYXK(粤)2022-0006。实验前1周饲养于温度(22±2)℃，相对湿度40%～70%的SPF级动物房中。本实验内容经广州中医药大学第一临床医学院实验动物伦理委员会审核通过(20210921019)。

1.2实验药物及试剂 一贯煎方药组成：北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄15 g、枸杞子12 g、川楝子10 g。换算为大鼠灌胃等效剂量为5.76 g/kg，以此为中剂量，高剂量为11.52 g/kg，低剂量为2.88 g/kg；维酶素片购自河北环海药业有限公司(0.2 g/片)。N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)购自Fluka公司，大鼠总三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，Ki67抗体试剂盒购自武汉博士德公司，Anti-TGF-β1、Smad3、Smad4购自Santa Crutz公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.3实验方法 将大鼠按体重随机分组为空白组、模型组、维酶素组、一贯煎低剂量组、一贯煎中剂量组、一贯煎高剂量组，每组10只。空白组大鼠正常饮食饮水；其余各组大鼠采用自由饮用MNNG+乙醇灌胃+饥饱失常多因素法制备CAG癌前病变模型：将100 μg/mL MNNG溶液装于外涂黑漆的水瓶中，每日更换，大鼠自由饮用12周，同时给予40%乙醇溶液灌胃，并辅以饥饱失常(2 d饱食，1 d禁食)，12周后取胃黏膜做病理学观察，以出现固有腺体萎缩、异型增生等形态学改变为造模成功。模型制备成功后，一贯煎低、中、高剂量组分别给予4.84，9.68，19.35 g/kg一贯煎灌胃，维酶素组给予0.3 g/kg维酶素灌胃，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，持续灌胃12周。

1.4观察指标及方法

1.4.1胃黏膜血流量 灌胃结束后，采用中性红清除法测定各组大鼠胃黏膜血流量：采用水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，经尾静脉采血1 mL后固定大鼠，切开腹壁，分离股静脉和股动脉，经十二指肠向胃内插管，收集0.5 mL胃液作为对照，沿右股静脉输注4 mg/kg的中性红溶液2 mL，输注完成后再以微量注射泵继续输注4 mL的中性红溶液，每隔15 min收集1次胃液，共收集2 h，随后取血4 mL，采用分光光度计法于540 nm下分别测定胃液、血液的中性红浓度，计算胃黏膜血流量(胃液中性红浓度/血液中性红浓度×单位时间内胃液分泌量)。

1.4.2胃黏膜组织形态学 灌胃结束，各组大鼠腹主动脉取血后处死，取部分胃黏膜组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，分别放入梯度乙醇溶液和二甲苯中水化和透明，液体石蜡中包埋，切片机切5 μm厚切片，经脱蜡至水、苏木素-伊红(HE)染色、盐酸酒精分化后，再置于梯度乙醇中水化，二甲苯透明，采用中性树胶封片，于倒置光学显微镜下观察各组大鼠胃黏膜组织形态并拍照。

1.4.3胃黏膜组织Ki67阳性表达情况 采用免疫组织化学法检测：取制备好的胃黏膜组织石蜡切片，滴加0.3% H2O2封闭20 min，蒸馏水水洗后进行抗原热修复，滴加5% BSA封闭20 min，滴加一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜，滴加二抗于37 ℃温育20 min，滴加SABC 37 ℃温育20 min，滴加DAB显色剂，蒸馏水水洗，中性树胶封片，倒置光学显微镜下观察Ki67的阳性表达情况，随机选取5个视野，采用Image J软件计算平均光密度值。

1.4.4血清中甲状腺激素水平 取各组大鼠腹主动脉血，离心机3 000 r/min下离心分离血清，分装保存于-20 ℃冰箱。血清临用前置于室温平衡1 h，3 000 r/min离心20 min，吸取上清，按照试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中T3、T4和TSH水平。

1.4.5胃黏膜组织TGF-β1/Smad通路相关因子蛋白表达情况 采用Western blot法检测：取各组大鼠部分胃黏膜组织，剪碎后加入裂解液于冰上裂解，提取组织总蛋白，采用BCA试剂盒于562 nm波长下测定蛋白浓度。蛋白样本于水浴锅中煮沸变性，制备分离胶和浓缩胶，经蛋白样品上样，凝胶电泳分离，PVDF转膜后加入5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加一抗(1∶1 000)于4 ℃冰箱过夜，TBST清洗，加入二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，洗膜，滴加ECL，凝胶成像系统曝光，以β-actin为内参，用Image J软件分析条带灰度值，分别计算TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白相对表达量。

1.4.6胃黏膜组织中TGF-β1/Smad通路相关因子mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测：取各组大鼠部分胃黏膜组织，剪碎研磨后采用Trizol一步法提取组织总RNA，采用紫外分光光度仪测定组织中RNA浓度，将RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，按RT-PCR试剂盒步骤检测TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA表达量。反应参数：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共扩增 40个循环，以β-actin为内参，mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。TGF-β1引物序列：上游为5’-CCAAGGAGACGGAATACAGG-3’，下游为5’-GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG-3’；Smad3引物序列：上游为5’-GAATCCACGAGCAGAGCAACG-3’，下游为5’-TCGAGGTGACACGCCTCAGTC-3’；Smad4引物序列：上游为5’-TCAGCCAGCTACTTACCACCA-3’，下游为5’-ACACGTCCCCTTCACCTTTAC-3’；β-actin引物序列：上游为5’-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3’，下游为5’-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3’。

㊴《文孙氏证言》，载朱成山主编《侵华日军南京大屠杀幸存者证言》，社会科学文献出版社2005年版，第470页。

2 结 果

2.1各组大鼠胃黏膜血流量比较 空白组、模型组、维酶素组、一贯煎低剂量组、一贯煎中剂量组和一贯煎高剂量组大鼠胃黏膜血流量分别为28.79±4.81，11.65±4.29，25.43±5.17，17.34±6.24，19.38±4.49，23.62±6.02。模型组大鼠胃黏膜血流量明显少于空白组(P<0.05)；维酶素组和一贯煎各剂量组大鼠胃黏膜血流量均明显多于模型组(P均<0.05)，且维酶素组和一贯煎高剂量组明显多于一贯煎低剂量组(P均<0.05)。

2.2各组大鼠胃黏膜组织形态 HE染色显示，空白组大鼠胃黏膜细胞、腺体排列规整，未见损伤和炎性浸润；模型组大鼠胃黏膜细胞排列不规则，胃黏膜变薄，腺体萎缩，固有层大量浆细胞、淋巴细胞浸润，可见部分黏膜细胞出现异型增生；与模型组比较，维酶素组和一贯煎各剂量组大鼠胃黏膜细胞排列较整齐，腺体排列较规则，腺体萎缩和炎细胞浸润减少，异型增生情况明显改善，其中维酶素组和一贯煎高剂量组改善更明显。见图1。

图1 空白组和慢性萎缩性胃炎癌前病变各组大鼠胃黏膜组织形态(HE，×200)

2.3各组大鼠胃黏膜Ki67表达情况 空白组大鼠胃黏膜仅见少量Ki67阳性表达，平均光密度值为0.003±0.002；模型组大鼠胃黏膜中Ki67阳性表达明显增多，平均光密度值为0.014±0.003，明显高于空白组(P<0.05)；维酶素组和一贯煎低、中、高剂量组大鼠胃黏膜中Ki67阳性表达明显减少，平均光密度值分别为0.004±0.003，0.008±0.005，0.007±0.003，0.006±0.004，均明显低于模型组(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和慢性萎缩性胃炎癌前病变各组大鼠胃黏膜组织Ki67阳性表达情况(IHC，×200)

2.4各组大鼠血清T3、T4、TSH水平比较 模型组大鼠血清T3、T4、TSH水平均明显低于空白组(P均<0.05)；维酶素组和一贯煎各剂量大鼠血清T3、T4、TSH水平均明显高于模型组(P均<0.05)；一贯煎各剂量组血清T3、TSH水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；一贯煎中、高剂量组血清T4水平均明显低于一贯煎低剂量组(P均<0.05)，且一贯煎高剂量组明显低于一贯煎中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 空白组和慢性萎缩性胃炎癌前病变各组大鼠血清T3、T4、TSH水平比较

2.5各组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1/Smad通路相关因子蛋白表达情况 与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)，Smad3、Smad4蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，维酶素组和一贯煎各剂量组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)，Smad3、Smad4蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)；一贯煎各剂量组TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

2.6各组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1/Smad通路相关因子mRNA表达情况 与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)，Smad3、Smad4 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，维酶素组和一贯煎各剂量组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)，Smad3、Smad4 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)；一贯煎各剂量组TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 空白组和慢性萎缩性胃炎癌前病变各组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1/Smad通路相关因子mRNA相对表达量比较

3 讨 论

胃癌早期症状不明显，且缺乏特异性的诊断标志物，多数患者明确诊断时已是晚期，预后较差[7]。CAG属于胃癌癌前病变，以黏膜萎缩、炎症和不典型增生等病理学表现为主要特征[8]，如何防止其向胃癌转化是临床重点关注的问题。

Ki67是一种细胞增殖因子，与恶性肿瘤生长、转移及预后密切相关，其阳性率可反映肿瘤细胞生长情况和恶性程度[13]。本实验中模型组大鼠胃黏膜中Ki67阳性表达明显增多，一贯煎各剂量组阳性表达较模型组明显减少，提示一贯煎可有效减轻病变黏膜组织的增殖活性，降低CAG癌变风险。

中医学认为肝与脾参与调节机体的情志活动与津血代谢，肝脾虚损常可涉及现代内分泌系统的异常，与甲状腺代谢功能的减退联系密切[14]。以往实验研究发现，肝郁脾虚大鼠血循环中甲状腺激素含量显著降低[15]。本实验中，模型组大鼠血清T3、T4和TSH水平较空白组显著降低，一贯煎各剂量组血清T3、T4和TSH水平均较模型组明显升高，提示一贯煎可调节下丘脑-垂体-甲状腺轴功能。

TGF-β1是一种能调控增殖、分化、凋亡等生物学过程的多效生长调节因子，通过活化其下游的Smad信号转导蛋白发挥生物学作用[16]。相关研究表明，在CAG胃黏膜组织中存在TGF-β1的过度表达[6，17]，TGF-β1可通过促进平滑肌细胞增生及异型细胞的增殖参与CAG发病过程[18]。Smad3蛋白能够抑制TGF-β1的活化和增殖功能，其通过与Smad4结合并形成转录复合物后，负向调节TGF-β1介导的信号通路[19]。本实验结果显示，模型组大鼠胃黏膜组织中TGF-β1表达上调，Smad3、Smad4表达下调；一贯煎各剂量组与模型组比较，TGF-β1表达下调，Smad3和Smad4表达上调。提示一贯煎能够有效抑制CAG大鼠体内TGF-β1/Smad通路的活性。

综上所述，一贯煎可逆转CAG大鼠胃黏膜病变，调节大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴功能，作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad通路的激活有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。