化浊解毒方对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织TGF-β1、α-SMA、HGF蛋白及其mRNA表达的影响

李宗涛，魏宏宇，刘丰睿，魏 曼，高 卉，冯 忖，魏晓娜

(1.河北中医学院研究生学院，河北 石家庄 050091； 2.河北省中医院，河北 石家庄 050011)

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是由于各种原因引起的肾脏结构或功能破坏，主要表现为肾小球滤过率下降、代谢产物潴留、水-电解质和酸碱平衡失调、全身各系统受累等。目前，CRF的治疗原则主要以积极治疗原发病，避免和纠正CRF进展的危险因素，防治并发症以及进行血液净化为主[1]。CRF患者的肾脏病变呈进行性发展，多为不可逆。中医药在治疗CRF方面具有丰富的经验和明显的疗效，表现在患者临床症状明显改善、尿蛋白含量减少、肾功能恶化延缓[2]。随着对慢性肾脏病的不断认识，国医大师李佃贵提出从“浊毒”论治CRF并取得一定效果。

“浊毒”既是一种致病因素，同时也是一种蕴积于体内的病理产物[3]。浊属阴邪，浊邪多易阻滞脉络，壅塞气机；毒属阳邪，性烈善变，易损害气血营卫。浊、毒两者常相互胶结致病，故常“浊毒”并称。CRF的发病原因复杂，病程绵长，病邪作用于人体，极易发展为浊毒内壅，故临床治疗时当以“浊毒”论治[4]。本课题组以李佃贵的“浊毒”理论为指导，确立了化浊解毒法治疗CRF的方案，总结出具有健脾补肾、化浊解毒功效的化浊解毒方(基础方)：黄芪、炒白术、积雪草、土茯苓、水蛭、莪术、石见穿、萆薢、酒大黄、水牛角。本方可改善患者临床症状，减少尿蛋白，延缓肾功能衰竭进展并有效提高患者生存质量，但其作用机制尚不明确，故本研究采用5/6肾切除法复制CRF大鼠模型，探究化浊解毒方治疗CRF的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 60只SPF级SD雄性大鼠，6周龄，体质量约180 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证号：SCXK(京)2016-0006]，饲养于河北中医学院实验动物中心动物房(相对湿度50%～70%，温度23～25 ℃，昼夜各半)。本实验由河北中医学院实验动物伦理委员会审核通过，伦理审查编号为DWLL2021118。

1.2 主要试剂 抗Actin抗体(批号 GB12001)、抗转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抗体(批号 GB111876)、抗α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗体(批号 GB111364)、BCA蛋白定量检测试剂盒(批号 G2026)、RNA提取液(批号 G3013)、Servicebio®RT First Strand cDNA分析试剂盒(批号 G3330)、2×SYBR Green qPCR反应混合物(无ROX)(批号 G3320)、PCR引物：武汉赛维尔生物科技有限公司；抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)抗体(批号 A1193)：ABclonal。

1.3 主要仪器 低温型研磨仪(型号 KZ-Ⅲ-FP)：武汉赛维尔生物科技有限公司；台式高速冷冻型微量离心机(型号 D3024R)：大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；荧光定量PCR仪(CFX)：美国Bio-rad。

1.4 药物 化浊解毒方(黄芪、积雪草各30 g，土茯苓20 g，炒白术、莪术、石见穿、萆薢、水牛角各15 g，酒大黄9 g，水蛭3 g)智能配方颗粒：广州一方药业集团有限公司；尿毒清颗粒(批号 20210404，每袋5 g)：康臣药业有限责任公司；氯沙坦钾(每片50 mg，批号 T030149)：杭州默沙东制药有限公司。

2 方法

2.1 CRF大鼠模型复制与分组 将60只大鼠适应性喂养1周后，随机选取12只作为对照组，其余大鼠作为手术组。采用5/6肾切除法[5]复制CRF模型，在10%水合氯醛麻醉下分两次手术共切除5/6肾组织。术后2周，从手术组、对照组各随机抽取3只大鼠，检测血清肌酐(serum creatinine, SCr)，以SCr>53.93 μmol/L[6]作为模型复制成功的依据。随后将手术组随机分为化浊解毒组(11只)、尿毒清组(11只)、氯沙坦钾组(11只)、模型组(12只)。

2.2 给药方法 按照大鼠用药剂量是70 kg成人临床用药剂量6.3倍的换算系数[7]，化浊解毒组、尿毒清组的用药剂量分别为2.35、2.63 g/(kg·d)，氯沙坦钾组的用药剂量为5.25 mg/(kg·d)；对照组及模型组给予等量纯净水。连续灌胃给药12周。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠一般情况 观察各组大鼠的活动情况、精神状况、摄食量和饮水量、皮毛状态、尿量、死亡数量等，并记录体质量变化。

2.3.2 取材 给药12周后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉采血6～8 mL，置于不加任何抗凝剂的试管中静置，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于4 ℃冰箱中保存，用于测定肾功能。采血后采用颈椎脱臼法处死大鼠，并尽快取出肾脏组织。

2.3.3 肾功能检测 采用全自动生化分析仪检测大鼠SCr、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

2.3.4 肾组织形态学变化 将肾组织用4%多聚甲醛固定液充分浸泡48 h，取出，冲洗，用不同梯度的乙醇进行脱水处理，在二甲苯中透明，浸蜡，石蜡包埋固定，用切片机切成2 μm左右厚度的薄片，梯度乙醇脱水，用中性树胶封片，苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色，光学显微镜下观察肾组织形态学变化。

2.3.5 RT-PCR法检测肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表达水平 提取各组大鼠肾脏组织总RNA，稀释成相同浓度，以GAPDH为内参；以特异性引物反转录合成cDNA。程序：42℃ 15 min，85 ℃ 5 s，以cDNA为模板扩增基因片段；95 ℃ 10 min预变性，后95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCT法计算各目的基因的相对表达水平。引物序列(5′→3′)：GAPDH 上游引物为CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG，下游引物为GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT；HGF上游引物为CTCCTGCTTCCTGTCACCATC，下游引物为TTTCTGATGCACCTGTTGGC；TGF-β1上游引物为CACTCCCGTGGCTTCTAGTG，下游引物为CATAGATTGCGTTGTTGCGGT；α-SMA上游引物为ACCATCGGGAATGAACGCTT，下游引物为CTGTCAGCAATGCCTGGGTA。

2.3.6 Western blot法检测肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表达水平 以裂解液(使用前加入蛋白酶抑制剂)提取冰冻肾组织蛋白质，并用BCA法测定其含量。将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5倍还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min。经电泳、转膜、牛奶封闭、一抗(α-SMA、HGF、TGF-β1、Actin的稀释比例均为1∶1 000)孵育过夜、荧光二抗(1∶3 000)孵育后，TBST清洗显影。应用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，并以目的蛋白与Actin灰度值的比值表示蛋白相对表达水平。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 结束实验时，对照组大鼠反应敏捷，皮毛密集有光泽，精力旺盛，进食、活动无明显异常，尿量正常，体质量增长较其他组明显。模型组大鼠精神不振，皮毛枯槁蓬松无光泽，进食、活动均减少，尿量明显减少，体质量降低。化浊解毒组、尿毒清组、氯沙坦钾组大鼠反应均较模型组灵敏，进食及活动量无明显减少，尿量较模型组稍增多，体质量均有所增加，其中化浊解毒组大鼠一般情况改善较为明显。对照组大鼠无死亡，模型组死亡4只，化浊解毒组死亡2只，尿毒清组死亡3只，氯沙坦钾组死亡3只。

3.2 5组大鼠SCr、BUN水平比较 与对照组比较，模型组大鼠BUN、SCr水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组BUN、SCr水平均显著降低(P<0.05)；化浊解毒组BUN、SCr水平显著低于氯沙坦钾组及尿毒清组(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠SCr、BUN水平比较

3.3 5组大鼠肾组织病理变化比较 对照组大鼠肾小球与肾小管结构清晰，未见明显病理变化。模型组大鼠肾脏结构异常，异常区域内肾小球消失，肾小管极度扩张，内含大量浆液样物质，同时上皮细胞扁平化，基底膜增厚，间质内胶原纤维增生伴淋巴细胞浸润。尿毒清组大鼠肾小球硬化，肾小管扩张，间质增生伴淋巴细胞浸润。氯沙坦钾组肾小球内细胞数量增多，间质增生，肾小管纤维化。化浊解毒组肾血管瘀血，间质增生伴淋巴细胞浸润，并可见肾小管纤维化。与模型组比较，尿毒清组、氯沙坦钾组、化浊解毒组纤维化均有不同程度减轻。见图1。

注：A.对照组；B.模型组；C.尿毒清组；D.氯沙坦钾组；E.化浊解毒组；示正常的肾小管和扩张的肾小管，示正常的肾小球和肥大的肾小球，示间质纤维化，示肾血管，示炎症细胞浸润

3.4 5组大鼠肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，尿毒清组、氯沙坦钾组和化浊解毒组大鼠肾组织 TGF-β1、α-SMA mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，HGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；尿毒清组、氯沙坦钾组和化浊解毒方组大鼠肾组织 TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 5组大鼠肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA mRNA

3.5 5组大鼠肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组TGF-β1、HGF、α-SMA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，尿毒清组、氯沙坦钾组和化浊解毒组肾组织TGF-β1、α-SMA表达水平显著降低(P<0.05)，α-SMA表达水平显著升高(P<0.05)；尿毒清组、氯沙坦钾组和化浊解毒方组TGF-β1、HGF、α-SMA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2、表3。

表3 5组大鼠肾组织TGF-β1、HGF、α-SMA

注：A. 对照组；B.模型组；C.尿毒清组；D.氯沙坦钾组；E.化浊解毒组

4 讨论

CRF属于中医学“水肿”“肾风”“肾劳”“溺毒”“癃闭”和“关格”等范畴，其基本病机为“本虚标实”[8]。“浊毒”既是一种对人体经络气血脏腑阴阳均造成损伤的致病因素，亦是蕴积于体内的病理产物。浊毒之邪重在“浊”，浊邪久蕴，凝聚成毒，“浊”邪迁延不愈，易生变端，“毒”邪阻滞脉络，损害气血，两者常相兼致病，浊毒内蕴，损伤机体。病情迁延不愈，伤及脾肾。肾为先天之本，脾为后天之本，肾如薪火主水，脾如鼎釜主土，“水为万物之源，土为万物之母，二脏安和，一身皆治，百疾不生”(《医宗必读·虚劳》)。脾喜燥恶湿，而浊为阴邪，其性重浊黏腻，易阻滞气机流动，治当健脾化浊；浊毒之邪内蕴日久，阳气被遏，肾阳衰微，毒邪损害机体，治当补肾解毒[4]。故CRF以脾肾两虚为本，浊毒内蕴为标。

化浊解毒方补肾健脾化浊，既固本以清源，又解毒以澄流。方中黄芪、白术补肾健脾、利水消肿，黄芪大补肺气以益肾水之上源，兼以达表固卫，白术健脾益气，使脾燥湿相济，两者共用，固本清源。积雪草、土茯苓、萆薢、水牛角四味共用，清热利湿、化浊解毒，肾衰日久，肾络瘀阻，以莪术、石见穿活血化瘀，又以水蛭破血通经、祛瘀生新；酒大黄通腑泄浊，给浊毒以出路，同时活血逐瘀、推陈致新。诸药合用，以达到缓解临床症状，保护残存肾功能，延缓CRF进展的作用。

CRF的主要病理机制为肾脏的纤维化，包括肾间质纤维化和肾小球硬化。其中肾间质纤维化与慢性肾脏病的发展与预后密切相关[9]。肾间质纤维化可由多种细胞因子介导、多通道信号转导而发生，其主要病理改变为肾脏中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)大量沉积，是其合成增多及降解减少共同作用的结果[10]。

TGF-β1主要在病变的肾脏组织中表达，是最重要的促纤维化因子，可促进ECM的合成，刺激上皮细胞分化，抑制ECM降解和在受损部位自我诱生，从而产生瀑布效应[11-12]。α-SMA是肌成纤维细胞表达的代表性蛋白[13]，在正常肾脏组织中很少表达，然而在病理情况下，在肾小球系膜区、肾小球周围间质、萎缩的肾小管周围纤维化区与血管周边明显表达与增生，并参与肾脏纤维化的形成[14]。实验[15]证明，肾小管间质损伤常常与α-SMA表达水平呈正相关，故α-SMA的过量表达可致肾脏纤维化不断加重。HGF是一种负性调节纤维化的因子，其不仅作用于肝细胞，也存在于多种脏器中，可作为一种亲肾因子在肾脏中表达，促进上皮细胞分裂，诱导上皮细胞迁移，影响细胞的增殖与分化，最终促进ECM降解[14,16-17]。此外，多项研究[18-20]发现，在肾间质纤维化进展的特定阶段，TGF-β1与HGF存在着互逆平衡的关系。即在慢性肾脏病发展的早期，TGF-β1和HGF的表达水平均上升，但HGF的表达水平升高时又会减缓TGF-β1的上升趋势；反之，当慢性肾脏病不断进展加重时，这种平衡被打破，肾脏的自我保护作用亦逐渐降低，TGF-β1不断升高，HGF的抑制作用减弱，并不断被TGF-β1抑制，从而降低自身表达水平。

本研究结果提示，伴随着CRF大鼠肾脏组织中TGF-β1的增高，HGF呈逐渐下降趋势，同时大鼠肾功能下降、肾脏纤维化程度加重，说明伴随着HGF的表达不断被TGF-β1抑制，其抗纤维化作用亦逐渐减弱，证明可通过促进HGF表达、抑制TGF-β1表达从而延缓肾功能衰竭的进展。但在CRF发展早期，TGF-β1与HGF的表达水平是否存在共同上升阶段，仍需进一步实验证实。

总之，本实验提示，TGF-β1的下降及HGF的升高可使α-SMA水平减少，说明化浊解毒方可能是通过抑制CRF大鼠肾脏组织中TGF-β1的表达并上调HGF的表达，从而起到抑制α-SMA表达的作用，达到改善CRF进展的目的。