肝细胞癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达及其临床意义

赵桓玉 张瑞瑞 张正卫 吴建 孙苏安

Glypican-3(GPC3)是一种膜结合蛋白多糖，吸附于细胞表面，参与细胞分裂、增殖，编码GPC-3蛋白，因此可在细胞膜上检测其表达模式[1,2]。研究证实，肝细胞癌(HCC)患者血清中可检测到GPC-3，HCC的形成及发展与GPC-3过表达密切相关[3-5]。本实验通过免疫组化检测HCC患者GPC-3及P53蛋白的阳性表达，探讨GPC-3与肝癌患者生存时间的关联，为HCC患者的预后评估提供参考。

材料与方法

一、研究资料

收集淮安市第一人民医院2014年1月至2015年4月91例HCC患者的临床资料。入组标准：①术前患者未得到任何治疗；②有完好的病理石蜡标本及完整的患者临床相关资料；③随访截止时间2020年4月1日。

二、试剂和方法

试剂盒包括显色试剂、抗体、修复液、封闭试剂等，抗体包括鼠抗人GPC-3抗体(货号ZM-0146)及鼠抗人P53抗体(货号ZM-0405)。取距肿块>1cm的正常肝脏组织32份作为对照组。将标本完全浸泡于中性甲醛24 h后取材、脱水、包埋、冷冻后切片，切片厚度约4 μm，玻片捞出后烤干。在二甲苯中脱蜡，经梯度乙醇溶液中脱水。苏木精伊红染色，按免疫组织化学SP法的步骤操作，用已知细胞膜或者细胞质GPC-3显示棕黄色的切片做阳性对照，实验室自制纯净水代替一抗做阴性对照，滴加DAB显色液显色。

三、结果判定

细胞质或细胞膜中GPC-3显示棕黄色或黄色为阳性。根据细胞染色的强度和着色细胞的百分率共同评分[6]。采用半定量积分法，打乱实验分组进行阅片：对于每张切片随机选择10个高倍视野，细胞未着色者或微弱着色记0分，细胞膜或细胞质显示淡黄色则为1分，显示黄色则为2分，显示棕黄色则为3分；另外根据记数细胞内着色细胞所占的百分率判断：≤10%记0分，11%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75% 记3分，76%～100%记4分。两者相乘为最终得分：≤2分判读阴性，>2分判读阳性。P53蛋白阳性可见细胞核显棕黄色或黄色，依据阳性细胞的百分率，<10%判读阴性，≥10%判读阳性[7]。

四、随访

观察HCC患者总生存时间，总生存期从手术确诊日起至最后随访死于原发肿瘤的死亡时间。随访时间至2020年4月。实验期间死于非肿瘤因素的记为删失值，失访患者不纳入实验。

五、统计学方法

SPSS 23.0统计学软件进行处理。应用χ2检验和Fisher精确法对两样本及多样本进行分析比较。采用Kaplan-Meier生存曲线显示HCC患者术后生存时间与GPC-3表达的关系，Log-Rank检验分析GPC-3不同表达模式之间生存曲线的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床资料

91例HCC患者中，女性13例，男性78例；中位年龄52岁(25～76岁)。HCC高分化32例、中分化45例、低分化14例。按2018年第8版AJCC的TNM分期标准：Ⅰ期、Ⅱ期共计64例，Ⅲ期、Ⅳ期共计27例。淋巴结无转移79例，有转移12例。32份癌旁正常肝组织中，有2份(6.3%)GPC-3蛋白阳性，而91份HCC组织中73份(80.2%)GPC-3蛋白阳性，差异有统计学意义(P<0.01)。HCC患者肝组织中GPC-3蛋白表达情况见图1。

图1 HCC中GPC-3蛋白的表达(SP×200)

二、GPC-3蛋白的临床意义

HCC患者GPC-3蛋白的表达与患者年龄、性别、是否伴随肝硬化及淋巴结有无转移无关(均P>0.05)；与HCC组织学分级及分期关系密切(P=0.010、0.011)，组织分化越好及分期越早，GPC-3阳性率越低；与阴性HCC患者相比，P53蛋白的表达在GPC-3阳性HCC患者中明显升高，差异有统计学意义(P=0.015)。见表1。

表1 GPC-3蛋白的临床意义

三、GPC-3表达对生存时间的影响

73例GPC-3阳性HCC患者中，66例死亡，生存率为9.6%，中位生存时间为33(1～71)个月；18例GPC-3阴性HCC患者中11例死亡，生存率为38.9%，中位生存时间为45(18～72)个月。GPC-3蛋白阳性组生存率和阴性组生存率差异有统计学意义(χ2=9.522，P=0.002)。2组患者5年生存率见图2。

图2 HCC患者GPC-3表达阴性和阳性者5年生存率

讨 论

治疗HCC方法很多，但治疗效果不佳，因此探讨新的分子靶向药物日益受到关注[8]。研究表明，相对于非癌肝组织及癌周组织，GPC-3在肝癌组织中表达增加，因此被认为是诊断HCC特异性和敏感性标志及靶向治疗最有前景的生物标记[9-11]。本研究结果显示，在HCC中GPC-3蛋白表达显著增高，为80.2%，而癌旁肝组织仅为6.3%，差异有统计学意义。

体外分子研究推测GPC-3与Wnt通路有关，Wnt蛋白与其受体结合激活GPC-3基因，GPC-3基因发生改变而导致GPC-3蛋白过表达，最终导致肿瘤的发生发展[12,13]。P53为抑癌基因，其参与基因转录，调节细胞生长。当P53突变时，丧失调节功能，无法进行DNA损伤修复[14]。本实验结果发现，GPC-3阳性HCC患者P53表达升高，与GPC-3阴性HCC患者相比，差异有统计学意义，提示P53与Wnt通路之间可能存在某种关联，但结论有待于大样本的验证。

本研究通过检测91例HCC患者中GPC-3蛋白的表达，发现GPC-3蛋白表达与患者组织学分级及TNM分期具有相关性，而与患者年龄、性别、有无肝硬化及有无淋巴结转移无关。研究证实，GPC-3在多种人类肿瘤中均有表达，并且认为GPC-3蛋白的高表达是预后差的一个危险因素[15]。本研究结果显示，91例HCC患者5年总生存率约15.4%。GPC-3阳性组HCC患者与GPC-3阴性组HCC患者生存率差异有统计学意义，表明GPC-3的表达对HCC患者的预后有明显影响。

本研究证实GPC-3 可作为肝细胞癌早期诊断指标，对评估HCC患者预后情况具有潜在的价值，因此，GPC-3有可能成HCC患者的治疗新靶标。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。