巨噬细胞在肺癌转移中的作用*

于盼 周奕阳 罗斌② 许帆 田建辉②③

最新流行病学数据显示，肺癌的死亡人数长期高居全球恶性肿瘤首位，而约90%的死亡由转移引起[1]，因此积极防治转移成为改善肺癌患者预后的关键。随着免疫检查点抑制剂的临床应用，晚期肺癌的临床疗效取得突破[2]，调控机体免疫已经成为引领肺癌治疗与研究的重要方向。然而肺癌转移的防控效率未得到有效提高，促使肿瘤免疫领域的研究热点逐渐从适应性免疫转向固有免疫[3]。巨噬细胞是固有免疫系统中含量最丰富的免疫细胞之一，具有复杂的表型和极强的可塑性，参与了肺癌转移的全过程[4]，因此靶向巨噬细胞治疗肺癌转移具有极大的潜力和研究价值。

1 巨噬细胞概述

巨噬细胞是机体固有免疫系统中重要的细胞组分，正常组织中的巨噬细胞包括组织驻留巨噬细胞和从外周血中招募的单核巨噬细胞。通常认为，组织驻留巨噬细胞来源于胚胎发育时期的卵黄囊，如肺-肺泡巨噬细胞，肝脏-库普弗细胞，脑-小胶质细胞等，而单核巨噬细胞的前体是来源于骨髓的单核细胞[5]。组织驻留巨噬细胞大量参与组织的维护和修复过程，维持环境稳态，当稳态受到破坏时即从外周血中招募单核巨噬细胞以加速免疫应答。有研究发现，单核巨噬细胞相较于组织驻留巨噬细胞具有更强的免疫效应[4]。受周围环境因素影响，巨噬细胞可极化为多种亚群，经典激活的巨噬细胞（M1）和替代激活的巨噬细胞（M2）是巨噬细胞的两个主要亚群[6]。M1型巨噬细胞分泌INF-γ、LPS、GM-CSF、TNF、IL-1β、IL-12、IL-18等促炎细胞因子，高表达CD68和MHC-II及CD80和CD86共刺激分子，介导对病原体的抵抗作用。而巨噬细胞在TGF-β、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13等细胞因子的刺激下可极化为M2型，高表达CD206，与肺癌的发生和进展关系密切[7]。

2 巨噬细胞促进肺癌转移的发生

巨噬细胞全程参与肺癌转移级联过程。肿瘤转移的发生是一个连续动态的过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱落、进入外周循环成为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、发生血管外渗进入靶器官定植成为播散肿瘤细胞（disseminated tumor cells，DTCs）[8]。原发灶肿瘤细胞可招募巨噬细胞浸润至肿瘤微环境成为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）[9]。临床研究发现，肺癌患者原发灶中的TAMs浸润的比例越高，预后越差[10]，而外周血中CD68+巨噬细胞比例明显高于健康人群[11]。转移相关巨噬细胞（metastatic-associated macrophages，MAMs）是近年来新发现的巨噬细胞群，在肿瘤转移的发展中具有特定的作用。肺癌原发灶肿瘤细胞可通过分泌外泌体、整合素、趋化因子等，调控外周血中的巨噬细胞向靶器官募集，成为MAMs，营造免疫抑制的转移前微环境（pre-metastatic niche，PMN），有利于靶器官中DTCs的存活和定植[12]。

3 巨噬细胞促进肺癌转移的机制

3.1 肿瘤相关巨噬细胞促进肺癌侵袭转移

TAMs通常被认为是M2型巨噬细胞，具有抑制免疫应答和促进肿瘤血管生成、侵袭、迁移的作用[13]。TAMs表面的CD40可与T淋巴细胞表面的CD40L结合从而抑制CD8+T细胞的免疫清除作用，减少肺癌细胞凋亡[14]。在低氧微环境中，原发灶肿瘤细胞产生的TGF-β、IL-6等细胞因子可将巨噬细胞极化为M2型，而TAMs将上调VEGF的表达和相关生长因子的分泌从而诱导血管生成，促进肺癌转移[15]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞从基底膜边界逃逸至周围基质并获得侵袭能力的关键环节。肺癌细胞经历EMT后将分泌更多的CCL2，招募并极化TAMs，使其浸润至肿瘤微环境中[16]。而TAMs分泌的TGF-β可激活肺癌细胞ERK1/2Fra-1/Slug信号通路，促进其发生EMT进而导致侵袭转移[17]。

3.2 单核巨噬细胞受肺癌CTCs调控增强CTCs的侵袭性

CTCs是导致肺癌转移发生的关键因素，肺癌患者术后在短期内CTCs数目迅速上升，与远期复发和转移有关[18]。目前关于CTCs和巨噬细胞的作用机制尚未完全明确。Hamilton等[19]建立了永生化的小细胞肺癌CTCs细胞系BHGc7/10，将其与外周血单核细胞共培养，发现单核细胞的表型向TAMs的表型改变。此外，肺癌CTCs可招募单核巨噬细胞并形成炎症特异性肿瘤微球体，表达大量CHI3L1、VEGF和MMP9，从而获得更强的侵袭性，有利于在靶器官发生血管外渗[20]。可见，肺癌CTCs通过调控循环中的单核/巨噬细胞增强了自身的侵袭转移能力。

3.3 转移相关巨噬细胞促进肺癌转移

肺癌常见的转移部位如肝脏、脑、骨、肺脏等均为血供丰富的器官，含有丰富的单核/巨噬细胞，MAMs是转移性肿瘤微环境中含量最丰富的免疫细胞之一[21]。在靶器官转移灶形成之前，MAMs已经被招募至PMN[22]，以VEGF-1依赖的方式促进新生血管的生成，为DTCs（种子）创造利基环境（肥沃的土壤）[23]。临床研究发现VEGFR1+MAMs亚群可促进肝转移灶血管生成，有望成为预测肝转移的生物标志物[24]。发生脑转移时，肿瘤细胞招募的单核细胞将穿透血脑屏障进入脑实质，与小胶质细胞协同浸润转移瘤，促进肺癌脑转移的进展[25]。小鼠的骨髓微环境有利于DTCs的休眠和存活，在正常的骨微环境中约半数以上的巨噬细胞向M2型极化，抑制T淋巴细胞和NK细胞的免疫监视和免疫清除作用，协助肿瘤细胞发生免疫逃逸，创造了天然的促肺癌转移微环境[26-27]。在肺转移动物模型中，CCL2招募单核细胞成为MAMs，而MAMs上的CCR2激活后分泌的CCL3将增强MAMs与肿瘤细胞的相互作用，并在CCR1和CCR5的介导下扩大MAMs细胞群数量[28]。MAMs还可通过TGF-β依赖机制抑制靶器官中自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）诱导的肿瘤细胞凋亡，而耗竭MAMs将逆转这一现象[29]。

4 靶向巨噬细胞防治肺癌转移

巨噬细胞参与了肺癌转移的全过程，靶向巨噬细胞防治肺癌转移已成为肿瘤免疫治疗的新策略，目前以抑制巨噬细胞增殖、减少巨噬细胞招募、抑制巨噬细胞M2样极化、抵抗巨噬细胞介导的肿瘤血管生成和免疫抑制等方向的研究正在开展，旨在研发针对转移的新药物，目前前期临床研究取得一定的疗效。

4.1 抑制巨噬细胞的增殖

集落刺激因子受体1（colony stimulating factor receptor 1，CSF1）信号对巨噬细胞的存活至关重要。在肺癌动物模型中，敲除或阻断CSF1/CSF1R将显著减少TAMs及MAMs的数量，证明阻断巨噬细胞的生存信号是防治肺癌发生发展的有效途径之一[30]。CSFR1抑制剂联合免疫治疗如pexidartinib联合帕博利珠单抗（NCT02452424）、emactuzumab联合阿替利珠单抗（NCT02323191）、cabiralizumab联合纳武利尤单抗（NCT02526017）等均已进入肺癌临床试验[31]。

4.2 减少巨噬细胞向肿瘤微环境及转移前微环境的招募

大量基础研究发现，CCL2-CCR2、CX3CL1-CX3CR1、CCL3-CCR1/CCR5等信号轴促进了TAMs和MAMs分别在肿瘤微环境（tumor micro-environment，TME）及PMN的募集。采用趋化因子/受体阻断剂在体外共培养与肺癌转移动物模型中观察到较好的疗效，抑制了巨噬细胞在原发灶及转移灶的聚集和浸润[32-33]，为临床防治肺癌转移的新药开发提供了新的思路。

4.3 抑制巨噬细胞的M2样极化

巨噬细胞的极化状态与肺癌转移的发生和预后显著性相关。黄芪甲甘Ⅳ能够通过抑制巨噬细胞中AMPKα的活化从而抑制极化，减少小鼠转移灶数目及瘤体中M2型巨噬细胞的浸润，达到防治肺癌转移的作用[34]。有研究发现，酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）吉非替尼和伊马替尼可通过抑制巨噬细胞M2样极化关键信号通路STAT6的磷酸化，下调M2样表面标志物CD206、CD163和特异性基因Mrc-1、Ym-1、Fizz1、Arg1等的表达，从而抑制其极化的发生，进而预防肺癌转移[35-36]。

4.4 抗巨噬细胞介导的肿瘤血管生成

内皮抑素是一种内源性抗血管生成蛋白，已获得国家食品药品监督管理局批准，用于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的抗肿瘤血管生成治疗。近年来有研究发现，内皮抑素可通过阻断p38 MAPK和Erk1/2信号通路抑制TAMs介导的肿瘤血管生成[37]。而内皮抑素联合长春瑞滨-顺铂可降低NSCLC骨转移患者的毛细血管通透性，提高化疗敏感性，延长生存期[38]。

4.5 抗巨噬细胞介导的免疫抑制作用

肿瘤浸润的巨噬细胞是肺癌中限制CD8+T细胞抗肿瘤免疫反应的免疫抑制细胞，其表达的PD-L1可与免疫检查点受体PD-1、CTLA4结合，以限制CD8+T细胞的活性。免疫检查点抑制剂和拮抗免疫抑制表型的小分子化合物可用于阻断巨噬细胞的免疫抑制作用[39]。如极化的巨噬细胞表达具有胶原结构的巨噬细胞受体（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO），并通过释放IL-37获得免疫抑制表型，而抗MARCO抗体将恢复细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）及NK细胞的免疫效应功能，下调调节性T细胞（regular T cells，Tregs）的活性，从而减少肺癌转移动物模型的转移灶数量[40]。

5 结语与展望

现代肿瘤学以肿瘤细胞为中心，基于对原发肿瘤细胞的精准分析制订治疗方案，近年来免疫疗法治疗晚期肺癌的临床疗效取得突破性进展[41]，使得肺癌的治疗思路逐渐从“以瘤为主”向“以人为本”转变。尽管肺癌的基础与临床研究进展迅速，然而肺癌的死亡率仍居高不下，其主要原因是缺乏成熟的理论指导肺癌转移的机制研究，因此亟需从理论角度突破肺癌转移防治的困境，进而创新肺癌转移机制研究策略，促进肺癌转移防治疗效的提高。田建辉教授在国医大师刘嘉湘先生指导下传承“扶正治癌”学术思想精华，创新性构建肺癌转移亚临床核心病机“正虚伏毒”学说[42]。其中“正虚”泛指免疫逃逸、免疫衰老等免疫功能紊乱；“伏毒”则包括了循环肿瘤细胞、播散肿瘤细胞、休眠肿瘤细胞等，该学说认为肺癌转移具有“正胜则伏而不作，正虚则出而为病”的致病特点。巨噬细胞是固有免疫中含量最丰富的免疫细胞之一，参与了肺癌转移全过程，与“正虚伏毒”学说中“正虚”状态密切相关。

巨噬细胞状态异常，尤其是M2型巨噬细胞在TME和PMN中比例上升，是机体内环境免疫功能紊乱的重要表现，极大程度上促进了肺癌转移的发生发展，是“正虚”的生物学基础之一。巨噬细胞的招募、增殖、极化、血管生成和免疫抑制等皆为肺癌转移的潜在治疗靶点，目前国内外研究者针对以上机制开展了大量研究，其中CSFR1抑制剂已经进入临床试验阶段，现行的抗血管生成靶向药物被发现具有抑制巨噬细胞极化的作用，中药单体也可作用于巨噬细胞从而发挥抗肺癌转移的作用。相关药物通过不同作用机制可逆转巨噬细胞的促转移作用，促使“免疫正常化”，从而达到抗肺癌转移的作用，是“扶正”现代内涵的重要体现。

尽管巨噬细胞在基础研究中呈现出巨大的治疗潜力，但仍缺乏远期疗效证据，且现存的抗转移研究局限于TAMs，对MAMs的促转移作用机制尚未完全明确。同时靶向TAMs的抗转移治疗仍处于抑制原发灶进展阶段的药物开发，对与外周循环中的CTCs和靶器官中的DTCs作用的巨噬细胞尚未采取干预措施。在“正虚伏毒”学说指导下，本课题组已率先建立世界首株人肺腺癌循环肿瘤细胞系（CTC-TJH-01）[43]，并在此基础上构建了肺癌转移特异性研究平台[44]，发现扶正中药具有干预肺癌转移前微环境及下调转移灶中M2型巨噬细胞浸润的作用[45]。基于该平台深入挖掘巨噬细胞与CTCs、DTCS间的相互作用机制，将为肺癌转移的关键靶点和新药研发提供思路，以期突破肺癌转移疗效提高瓶颈，丰富中医药“扶正”的现代生物学内涵，促进中西医融合贯通。