KLK14与恶性肿瘤转移关系的研究进展*

崔欣 叶联华

随着分子靶向治疗的兴起和广泛应用，恶性肿瘤的诊断和个体化治疗取得了积极的进展，但由于恶性肿瘤的高复发和转移率，目前病死率仍然较高。转移是恶性肿瘤细胞从原发病灶扩散到远处器官的过程，涉及包括细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、免疫逃逸、组织微环境的调节和耐药等多种细胞机制，由于癌症转移过程的综合性和复杂性，对这一复杂现象仍缺乏系统了解，限制了转移性疾病治疗的进展。因此，挖掘与肿瘤转移显著相关的新的分子标志物，并探索在肿瘤转移中的作用，对于深入了解恶性肿瘤的转移过程及肿瘤的诊治具有重要意义。

人组织激肽释放酶家族（Kallikrein-related peptidases，KLKs）是一类具有胰蛋白酶和糜蛋白酶双重活性的分泌型丝氨酸蛋白酶，其成员人组织激肽释放酶14（Kallikrein-related peptidase 14，KLK14）作为癌症发展过程中重要的信号分子，有望成为癌症个体化治疗的新靶点[1]。大量研究表明KLK14可以调节多种恶性肿瘤的发生和发展，并且参与到肿瘤细胞转移的各个阶段[2-4]。而肿瘤转移这一恶性肿瘤的基本生物学特性，是导致疾病难治和患者死亡的重要原因，本文将就KLK14在肿瘤转移中的作用和可能机制进行综述。

1 KLK14概述

KLK14是KLKs中的一员，其基因定位于染色体19q13.4，全长约5.4 kb，由7个外显子（5个编码的外显子）和4个内含子组成，其生物学功能由编码产物KLK14蛋白介导，其酶原前体由251个氨基酸构成，包含18个氨基酸构成的信号肽和6个氨基酸构成的活性肽，并具有胰岛素样和糜蛋白样活性[5]。

2000年，Hooper等[6]通过Northern blot分析以及原位杂交技术首次在正常前列腺上皮细胞、前列腺癌细胞以及骨骼肌中检测到KLK14基因的表达。KLK14广泛表达于多种组织，在中枢神经系统中，KLK14中度表达，与其他KLKs共同参与层黏连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白等细胞外基质的降解,以及蛋白酶激活受体-2的激活[7]。KLK14在皮肤中表达，激活皮肤脱屑的主要效应物KLK5和KLK7，并在体外直接降解桥粒核心糖蛋白-1，进一步参与表皮生理学[8]。而在恶性肿瘤细胞中观察到了KLK14表达的失调。研究发现，KLK14受类固醇激素的调节[9]，在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中对比正常组织均有不同程度的升高[4，9]，而随着对KLK14更深入的研究，在包括结直肠癌和非小细胞肺癌等非激素依赖性肿瘤中均发现KLK14的异常表达[10-11]。KLK14可以通过激活HGF/c-MET信号通路、膜型基质金属蛋白酶和降解细胞外基质等多种途径促进肿瘤细胞的浸润和转移[2，12]。

2 KLK14和肿瘤转移

肿瘤转移是恶性肿瘤的显著特征，也是导致癌症患者死亡的重要因素。近年来，越来越多的恶性肿瘤中发现了KLK14的异常表达，研究者推荐将KLK14作为恶性肿瘤转移及较差预后的分子标志物，并提出将其作为新的靶点以达到肿瘤治疗的目的。

2.1 KLK14与激素依赖性肿瘤

研究发现，KLK14受类固醇激素调节促进肿瘤进展和转移[9]。有研究表明，与正常前列腺组织相比，前列腺癌中KLK14的表达升高。Rose等[13]通过对TCGA数据库中前列腺癌的数据分析表明，高Gleason评分前列腺癌的KLK14 mRNA表达显著高于低Gleason评分的前列腺癌。特别是在检测到前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen/Kallikrein-related peptidase 3，PSA/KLK3）的复发患者中[14]。同时，与原发性前列腺癌相比，转移性前列腺癌中KLK14的表达显著升高[3]。KLK14与前列腺癌的关联也得到了遗传学研究的支持，KLK14基因的多态性与前列腺癌侵袭性显著相关[13]。以上证据提示靶向该基因可能提供一个新的途径来限制前列腺癌的进展和转移。KLK14在其他内分泌肿瘤中同样高表达，Georgia等[15]研究表明，在乳腺癌和正常组织标本中的表达分析显示，恶性肿瘤中KLK14的转录水平较正常组织更高，定量KLK14的表达可以作为乳腺良恶性病变鉴别诊断的独立生物标志物，同时，KLK14转录水平升高与肿瘤的形态大小呈正相关，且较高的KLK14基因水平与乳腺癌的侵袭性相关。在卵巢癌中，KLK14的表达水平高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤[9]。Zhang等[16]利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）下调KLK14基因在人卵巢癌细胞SK-OV-3和OVCAR-3中的表达，发现抑制KLK14可明显降低细胞的增殖和侵袭能力并增加细胞凋亡率，表明KLK14可能是治疗和抑制卵巢癌转移的潜在靶点。

而Dettmar等[17]在晚期高级别浆液性卵巢癌中观察到KLK14的表达与肿瘤预后呈负相关。相似的，在睾丸癌中，KLK14转录水平的表达相比正常组织下调[18]，但目前还无关于其与睾丸癌生存率相关性的研究。提示KLK14在不同种肿瘤细胞中可能存在双向调节，但其机制仍需进一步阐明。

2.2 KLK14与非激素依赖性肿瘤

随着研究的深入，在越来越多的非激素依赖性肿瘤中同样发现了KLK14表达的上调。由于结肠癌中可用标记物缺乏敏感性和特异性，Devetzi等[10]利用实时荧光定量PCR技术，检测了175例患者的245份结肠组织标本，证实KLK14在结肠癌中转录水平上调。进一步的受试者工作特征曲线分析显示，KLK14基因表达可作为结肠癌患者预后不良的生物标志物，并对结肠癌和腺瘤患者有较强的鉴别能力，而KLK14转录水平上高表达与阳性淋巴结状态和更晚的TNM分期具有显著性相关，分别为P=0.019和P=0.043，提示KLK14在结肠癌转移中发挥促进作用。

而KLK14在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表达存在争议，Planque等[19]采用qPCR技术，分析了57例原发性NSCLC患者配对样本中的KLK14 mRNA表达水平，与配对的癌旁组织相比，KLK14在NSCLC组织中高表达（P=0.022），进一步研究发现KLK14还与NSCLC的高风险相关，证实了KLK14可作为NSCLC患者预后的潜在生物标志物。而Tailor等[20]利用TCGA数据库分析了KLKs家族中的所有成员在15种肿瘤中的表达水平，结果显示在肺鳞癌和肺腺癌中KLK14的表达与正常组织比较差异无统计学意义 。Zhang等[21]通过对112例宣威女性肺腺癌和配对样本进行全外显子测序，利用mRNA-Seq技术对33例正常和115例肿瘤样本进行测序，并与TCGA数据库比较，将KLK14鉴定为显著突变基因，是潜在的宣威女性肺腺癌的驱动基因。然而关于KLK14对NSCLC转移的影响及可能机制则需进一步研究。

3 KLK14促进肿瘤转移的分子机制

恶性肿瘤转移是一个多步骤的级联过程，包括局部侵袭，癌细胞进入附近的血管/淋巴管，进而到达远处组织形成微转移，最后定植形成转移灶 。而蛋白酶在癌症进展的几乎所有阶段都起着十分复杂的作用。特别是蛋白酶参与到了一些癌细胞从原发部位转移到继发部位的必要细胞事件[1]。KLKs可以通过降解ECM、促进EMT、免疫逃逸和促进血管生成等途径促进肿瘤细胞浸润转移。KLK14是KLKs家族中发现的新成员，可能在上述细胞生物学程序的调控中发挥重要作用，促进肿瘤细胞转移。

3.1 KLK14与ECM

ECM（extracellular matrix，ECM）是由细胞合成、分泌的生物大分子，在细胞表面或细胞之间构成复杂的网络结构，经典意义上的ECM包括胶原蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖及非胶原蛋白。KLKs家族在是维持ECM稳态所必须的蛋白水解酶，参与ECM重构[22]。而ECM重构可以促进血管生成过程中内皮细胞的迁移，以介导血管生成的方式促进恶性肿瘤转移。ECM在肿瘤细胞侵袭和转移中起关键作用，肿瘤细胞可以通过分泌各种酶类降解ECM，从而向周围及远处组织侵袭转移。

Kryza等[3]通过对前列腺癌细胞的蛋白质组学进行分析，发现包括硫酸肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）、集聚蛋白（agrin，AGRN）、多配体蛋白聚糖4（syndecan 4，SDC4）和模块化结合蛋白2在内的KLK14底物参与了ECM的形成，同时发现KLK14可以调节解整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）和ST14蛋白酶的活性，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。KLK14还可以通过选择性激活膜型基质金属蛋白酶（membrane-type matrix metalloproteinases，MT-MMPs）参与癌细胞转移的初始阶段[2]。在卵巢癌中也观察到了相似的结果，Zhang等[16]将KLK14小干扰RNA转染到人卵巢癌SK-OV-3和OVCAR-3细胞中并进行Western blot分析，结果显示存活蛋白（survivin）和MMP2的表达降低。Rajapakse等[4]将KLK14表达载体转染到卵巢癌细胞COS-7中，并活化和纯化重组KLK14蛋白进行生化和酶学表征，发现KLK14蛋白在卵巢癌中降解层黏连蛋白、纤维连接蛋白、I型胶原和IV型胶原，而这些ECM成分蛋白的降解被认为是癌细胞侵袭和转移的关键步骤。以上研究表明KLK14可以通过降解ECM或影响ECM重构促进肿瘤细胞的转移。

3.2 KLK14介导EMT

EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌细胞发展侵袭性表型所必需的，E-钙黏蛋白（E-cadherin）的减少和波形蛋白表达增加是EMT的显著特征[23]。有研究表明KLKs家族在调节EMT相关机制中发挥作用[24]。

蛋白酶激活受体-2（proteinase-activiated receptor-2，PAR-2）属于G蛋白偶联受体，作为各种蛋白水解信号传递的靶点参与到包括肿瘤在内的多种病生理过程[25]，可被KLKs家族激活。有研究表明，PAR-2的表达在多种恶性肿瘤中显著升高，并且可以通过促进肿瘤细胞侵袭和转移加速肿瘤进展。在肝癌细胞中PAR-2的激活可以诱导人肝癌LX-2细胞形成EMT所特有的丝状伪足，并且可以通过 Src 蛋白激酶、Met蛋白、p42/P44 MAPK 信号通路和 MMP 依赖的方式增加肿瘤细胞的迁移能力[26]。Wu等[27]利用TCGA数据库进行生物信息学分析发现，PAR-2过表达有利于肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而影响患者的预后。同样，Tsai等[28]研究发现，在肺腺癌细胞系CL1-5和H1299中，PAR-2通过Slug介导的EMT促进肿瘤细胞迁移。Chung等[29]发现KLK14和PAR-2在结肠癌细胞中过表达，并且在人结肠癌HT-29细胞中，KLK14可以通过自分泌/旁分泌的方式裂解和激活PAR-2，利用共聚焦显微镜观察到经KLK14处理后的PAR-2迅速内化并在胞内弥漫性定位，进而发挥促癌作用。这些结果表明，KLK14可以激活PAR-2并通过其下游信号途径介导的EMT促进肿瘤细胞的转移。

然而，由于KLKs家族中的其他成员，如KLK6抑制乳腺癌进展可能是通过抑制EMT介导[30]。因此，关于KLKs家族促进还是抑制EMT尚未形成共识，仍需要更多的研究加以阐明。

3.3 KLK14与免疫逃逸

免疫系统是肿瘤发生和发展的重要障碍，恶性肿瘤细胞可以通过消除诱导效应细胞、破坏关键信号通路、对细胞毒性的抗性以及逃避免疫反应的策略逃避免疫系统[31]。有研究发现KLKs家族与免疫逃逸机制间存在联系，如KLK5和KLK7可以通过降解LL-37进而介导免疫-肿瘤微环境的调控[32]。

KLK14能有效降解补体系统级联反应的中心组分补体C3[33]进而发挥外部补体的作用。补体网络是先天免疫系统的重要组成成分，补体C3是免疫细胞激活中发挥广泛生物学效应的主要信号效应分子之一。因此，补体C3的水解激活构成了可能有助于肿瘤免疫逃逸的机制。但由于相关研究有限，KLK14与免疫逃逸之间的具体作用机制需要进一步研究。

3.4 KLK14与HGF/c-Met信号通路

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是由间质细胞产生的一种活性多肽，是致癌基因c-Met目前唯一已知的配体，在正常细胞中HGF激活c-Met后，细胞质中酪氨酸残基发生自身磷酸化，从而激活酪氨酸激酶。随后，多种效应蛋白被快速磷酸化发挥复杂的生物学功能[34]。HGF/c-Met信号通路在多种癌细胞转移的多个阶段均发挥关键作用，可以促进细胞增殖、侵袭和迁移[35]。HGF可以导致细胞间连接的不稳定、支持细胞骨架重构、控制整合素功能并刺激MMP介导的ECM蛋白水解，进而促进肿瘤细胞侵袭和转移[36]。一项研究也表明，胰腺癌细胞可通过上调MMP-9从而激活HGF/c-Met信号通路，促进胰腺癌以神经周浸润的方式形成肿瘤转移和局部复发[37]。另外，研究表明，HGF/c-Met信号通路可通过细胞可塑性中的关键作用和增加与肿瘤微环境的串扰促进免疫逃逸[38]。

Reid等[14]提出KLK14可以通过激活HGF影响HGF/c-Met信号级联。更深入的研究发现，KLK14以蛋白水解的方式抑制肝细胞生长因子激活物抑制剂-1（hepatocyte growth factor activator inhibitor type-1，HAI-1），而HAI-1可以显著抑制HGF的激活[12]。综上所述，KLK14可能通过HGF/c-Met信号通路的激活促进肿瘤细胞的增殖、浸润、转移和免疫逃逸。

3.5 KLK14与胰岛素样生长因子结合蛋白-3

胰岛素样生长因子结合蛋白-3（insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）是一种p53抑癌基因调控蛋白，是肿瘤发生的负性调控因子。其特异性受体IGFBP-3R已经被证明与IGFBP-3诱导的癌细胞核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）活性的抑制有关，进而增强对肿瘤生长、侵袭和转移的抑制作用[39]。自分泌移动因子（autocrine motility factor，AMF）又称磷酸葡萄糖异构酶（phoshoglucose isomerase，PGI）是一种肿瘤细胞分泌的细胞因子，可通过自分泌途径进入胞内调节细胞迁移和增殖，而IGFBP-3被证明能够在人乳腺癌细胞T47D和MCF-7中抑制AMF/PGI诱导的细胞迁移[40]。在胰腺导管腺癌中，肿瘤组织相比正常胰腺组织中的IGFBP-3R表达降低，且与预后不良相关[41]。目前的研究结果均表明，IGFBP-3/IGFBP-3R信号通路可能是一种新的抗肿瘤/抗转移信号通路，是新的潜在癌症治疗靶点[42]。

研究发现，KLK14蛋白具有胰蛋白酶样活性，并且能够快速水解IGHBP-3[4]。基于以上研究，KLK14可能在体内通过水解IGFBP-3抑制IGFBP-3/IGFBP-3R信号通路，进而促进肿瘤细胞的转移，但仍需要更多的研究进行验证。

4 结语及展望

精准医学是随着人类社会的健康需求提高和科学技术不断发展而兴起的新的医疗理念和模式，分子标志物的发现和应用是未来我国精准医学的重点任务。KLK14参与多种病理生理过程，并与包括侵袭和转移在内的多种肿瘤细胞恶性生物学行为显著相关，这提示KLK14在肿瘤的诊断、治疗及预后中具有巨大的潜在研究价值。至今，在多种肿瘤细胞中都观察到KLK14表达的上调，检测其表达可以反应肿瘤状态，有效预测患者预后。而在睾丸癌和晚期高级别浆液性卵巢癌中存在KLK14表达下调则提示，KLK14在不同恶性肿瘤中可能存在双向调节。最近，在宣威女性肺腺癌中的发现将KLK14鉴定为潜在的驱动基因，为全球死亡率最高的区域性肺癌的诊断及精准治疗提供了新的潜在靶点。同时，由于KLK14下游靶点的信号通路和蛋白水解级联反应的多样性，其在调节恶性肿瘤转移之外还参与包括肿瘤细胞增殖和血管生成等多种生物学行为的改变。随着研究的不断深入，KLK14有望为恶性肿瘤的诊断及个体化治疗提供新靶点和新思路。