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中医药调控MAPK信号通路治疗类风湿关节炎的研究进展

2022-12-08乌力吉高飞包书茵付强

中医药信息 2022年1期
关键词:激酶滑膜磷酸化

奥·乌力吉,高飞,包书茵,付强✉

(1. 内蒙古蒙医药工程技术研究院,内蒙古 通辽 028000;2. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3. 内蒙古民族大学医学院,内蒙古 通辽 028000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种全身性自身免疫性疾病,多见于中年女性,我国患病率约为0.32%~0.36%[1]。主要累及关节,以慢性滑膜炎症为特征。病因可能与免疫细胞、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、遗传等因素有关[2]。因其病机复杂,目前尚无特效治疗方案,主要以减轻症状,延缓病情为主。常用药物主要有非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs),如阿司匹林、沙利度胺、糖皮质激素类药(glucocorticoids,GCs)、甲氨蝶呤等改善病情抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),以及生物制剂。但往往伴随肝肾不良反应、过敏、物质代谢紊乱等副作用[3]。随着中医药现代化的发展,其整体调节、多靶点、低毒副作用的优势被逐渐认可,临床中与西药联合应用可减毒增效。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是RA 进展中重要的炎症因子信号转导通路,与MMP合成及促炎因子的产生等关系密切。本文从中药提取物及有效部位、中药复方、中医物理治疗方面详细阐述中医药通过调控MAPK信号通路治疗RA的研究进展。

1 MAPK信号通路概述

MAPK 是丝氨酸-苏氨酸激酶家族,是信号从细胞膜到细胞核传导的重要通路[4]。MAPK 有三个主要家族——细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPKα、β、γ、和δ)、c-Jun 氨基末端激酶1/2/3(JNK 1/2/3)。MAPK的激活途径为典型的三级酶促级联反应。在上游生长因子与特定受体结合后,通过MAPKKK-MAPKK-MAPK 的逐级磷酸化,调控其下游转录因子,进而对细胞的增殖、凋亡、迁移及分化等功能进行调节[5]。

1.1 ERK信号通路

表皮生长因子(EGF)通过受体(EGFR)(受体酪氨酸激酶)启动细胞表面的信号后,GTP取代GDP与小G蛋白Ras结合,Ras被激活,并召集细胞质内Raf丝苏氨酸蛋白激酶至细胞膜上,Raf激酶磷酸化激酶丝裂原蛋白激酶激酶1 和2(MEK1/2)上的两个丝氨酸残基,进而再通过磷酸化激活ERK1/2。ERK1/2 通过多种机制调控细胞增殖、分化及凋亡等,因其能够诱导细胞周期的正调节因子,所以对细胞增殖方面起着关键作用[6]。

1.2 p38MAPK信号通路

多种细胞外信号,如细胞应激和促炎细胞因子,都可以激活p38MAPK 通路,其中MAPKKKs 磷酸化p38 MAPK特异性MAPKKs(MKK3、MKK4或MKK6),继而磷酸化p38MAPK 的4种同工型(α、β、δ和γ)以及p38α和p38β 的3 个可变剪接变体。磷酸化底物继而引发各种生物反应,包括炎症、细胞凋亡、增殖、细胞周期调节和分化等,特别是与炎症介质的调节有关[7]。

1.3 JNK信号通路

JNK 可以受多种的细胞外刺激而激活,如肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、紫外线照射和缺血/再灌注损伤等[8]。其上游激酶目前确认的有MKK7和MKK4,通过双磷酸化JNK 的Thr、Tvr 位点进行传导,JNK 能够磷酸化并激活许多核蛋白和非核蛋白,包括c-Myc、p53、细胞死亡调节因子线粒体中的Bcl-2家族等。这些蛋白质控制着多种细胞反应,如增殖、分化、凋亡[9]。

细胞内每条MAPK 信号转导通路具有相对独立的功能,并在受到不同的外界刺激后以级联放大的方式传导,但这3 条信号转导通路并不是简单的线性关系,上游分子及下游底物均存在“串话(crosstalk)”[10]。这使得3 条信号转导通路之间相互影响,进而产生生物学效应。

2 MAPK通路与RA

MAPK 信号通路在与RA 发病机制相关的细胞因子的转录激活中发挥重要作用[11]。在受损关节组织中,MAPK 不仅调节促炎细胞因子的产生,而且在白介素(interleukin,IL)-1、IL-17 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 受体下游的信号级联中发挥重要作用[9]。滑膜关节慢性炎症是RA 的主要特征。成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)中促炎细胞因子和MMP呈上调表达,能够促进滑膜细胞肥厚、增生并引起炎症细胞浸润。ERK 信号传导通路活化可促进T 细胞的增殖,使多种细胞因子的分泌水平显著提升,并导致单核细胞和巨噬细胞聚集激活,进而使滑膜组织分泌TNF-α、IL-1、IL-6、MMP及黏附分子等,这些生物小分子促进RA-FLS过度增殖并抑制凋亡,形成恶性循环。同时,ERK 信号通路主要调节细胞增殖和分化,这两个过程直接影响RA 的滑膜组织重塑[12]。软骨细胞的功能正常是维持关节软骨形态稳定的关键因素,软骨破坏是RA 关节损伤的一个重要病理环节。WADA 等[13]研究表明,经p38MAPK 抑制剂干预后,IL-1β 介导的人软骨细胞MMP 和环氧化酶(epoxidase,COX)-2 表达显著降低,胶原降解受到抑制,具有一定的软骨保护作用。HASHIMOTO 等[14]研究证实p38MAPK 的活化与RA 软骨细胞凋亡密切相关。IL-6 通过激活ERK 和JNK 信号传导通路,从而引起MMP-1、MMP-3 和MMP-13表达上调,促使关节软骨细胞基质降解[15]。在RA 骨破坏进程中,破骨细胞的过度活化是主要因素。ZWERINA 等[16]研究表明,p38MAPK 抑制剂能抑制体外培养的破骨细胞的增殖,并在体内实验中抑制骨破坏。LEE 等[17]研究也发现,ERK 活性突变体能够延长破骨细胞存活时间。

此外,MAPK 信号通路还与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、核因子κB(nuclear factor,NFκB)等通路存在交叉联系,协同影响基因转录。综上,MAPK 在RA 关节的炎症和组织破坏进程中起到关键作用,并与RA 病理状态的进展密切相关。因此,可将调控MAPK 作为新的思路和途径,探究中医药治疗RA的作用机制。

3 中医药调控MAPK信号通路治疗RA研究进展

中医学认为RA 属“痹症”范畴,与中医古籍中所记载的“历节病”“顽痹”“鹤膝风”等相似。《黄帝内经》曰:“风寒湿三气杂至,合而为痹”,指出风、寒、湿是引起痹证的主因,其基本病机为邪气痹阻经脉,不通则痛。中医药治疗RA 依据辨证论治合理配伍药物,用药层次丰富、疗效稳定,可有效延缓疾病进展,在减轻症状方面有极大的优势。

3.1 中药提取物及有效部位

RA 的病理基础为滑膜炎,异常增生的RA-FLS能够产生大量炎性细胞因子和趋化因子,从而导致RA的炎症状态,并对软骨细胞进行侵蚀和破坏。因此,RA-FLS 成为治疗类风湿关节炎的一种至关重要的靶细胞。

大黄素是中药大黄中最主要的药理活性成分之一,通过抑制炎症细胞活化及炎症介质分泌从而发挥抗炎作用。研究发现,大黄素能够降低TNF-α 诱导的RA-FLS 中ERK1/2、p38MAPK 蛋白及mRNA 的表达,进而减少炎症因子释放,有效延缓RA 病情进展[18]。黄连清热燥湿、泻火解毒,其主要成分黄连素能够下调血清中的TNF-α 和IL-1 水平,具有较强的抗炎作用。蛋白质印迹(Western bloting,WB)和反转录聚合酶链式扩增反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)实验证实,调节溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)介导的RA-FLS经黄连素干预后,显著抑制RA-FLS中IL-6和TNF-α的过度增殖,同时下调K-ras、c-Raf 、P-p38MAPK 和PERK1/2的表达,以抗关节炎并抑制滑膜增生[19]。汉黄芩素为黄芩的主要活性单体成分,具有抗炎、抗肿瘤等药理作用。王慧莲等[20]发现,汉黄芩素能够诱导RAFLS 细胞凋亡,降低MMP 水平,可能与其调控ROS/p38MAPK 信号通路有关。苦参清热燥湿,为临床治疗热痹常用药,提取物苦参碱被我国批准用作免疫调节剂,具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎等药理作用。其衍生物MASM 可明显抑制IL-1β 介导的RA-FLS 中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-13)的表达,抑制RA-FLS 细胞增殖并上调自噬与凋亡水平,其可能通过抑制ERK1/2、JNK 和p38MAPK 的磷酸化发挥作用[21]。穿心莲内酯被誉为天然抗生素药物,有研究指出穿心莲内酯降低了TNF-α 诱导的RA-FLS 中p38MAPK 和ERK1/2 磷酸化,通过抑制MAPK 通路对自身免疫性关节炎产生保护作用[22]。益母草碱除了用于治疗传统妇产科疾病外,还具有降脂、降低血黏度、改善微循环等生物学功能。具有抗细胞凋亡、免疫调节等生物活性。李楠[23]通过实验证实,益母草碱是通过干预p38MAPK 介导的NF-κB 信号通路及JNK 信号通路,抑制RA-FLS 炎症因子、MMPs 的表达及其迁移侵袭的功能。白藜芦醇具有良好的抗风湿作用,能够多途径调控RA 相关的免疫细胞及信号通路发挥抗炎、抗骨侵蚀作用。有研究证实白藜芦醇阻断了IL-1β 介导的RSC-364 细胞中JNK 和p38MAPK 的磷酸化,抑制滑膜组织的炎症反应和细胞增殖,并促进细胞凋亡[24]。土贝母苷甲具有较强的抗炎、抗肿瘤和抗病毒的活性,刘振州[25]发现其可能通过抑制p38MAPK 和JNK 的磷酸化水平,进而减少RA-FLS 的IL-1β、IL-6 和IL-8 的分泌,减轻炎症反应,发挥治疗RA 的作用。紫草的主要活性成分紫草素具有抗炎、镇痛、免疫调节等多种生物活性,能够降低TNF-α 诱导的MH7A 细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力,其机制可能与下调P-p38MAPK,PERK,P-JNK 的蛋白表达水平,从而抑制MAPK 信号通路的活化相关[26]。

3.2 中药复方

胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠作为经典的RA 模型,其临床表现及病理学特质与RA 高度类似,被广泛运用于RA 的体内实验研究,大多数研究者通过对CIA 大鼠关节、滑膜的观察评估及HE 染色等实验方法,结合体外研究,以评估中药复方的疗效。根据RA 活动期的湿、热、毒、瘀病机所拟的痹肿消汤临床应用多年,肖玉美[27]及徐则林[28]通过实验证实其能够显著抑制CIA 大鼠p38MAPK、JNK、ERK1/2 及ERK5 的磷酸化水平,从而阻抑关节滑膜增殖和骨质侵蚀。清代医家程松龄的《医学心悟》中记载的蠲痹汤,具有祛风除湿、蠲痹止痛的疗效,研究表明其可有效抑制TNF-α 诱导的MH7A 细胞炎症因子及MMPs 基因和蛋白水平的表达,其发挥作用的机制可能和抑制p38MAPK、JNK 磷酸化相关[29]。以“补益肝肾、祛风除湿、化瘀通络”的基本治法拟定的断藤益母汤,通过研究发现,RA-FLS 经断藤益母汤干预后,MEKK2 蛋白及mRNA 表达水平下降,炎症因子MMP-1,TNF-α,IL-6表达水平显著降低,可能是其缓解RA炎症反应的重要机制之一[30]。二妙散出自《丹溪心法》,是中医治疗RA的经典方剂,王泽等[31]研究发现,经二妙散干预后,CIA 大鼠关节中NF-κB、p50、ERK1/2蛋白及mRNA 的表达水平低于模型组,在信号机制上论证了二妙散治疗RA 的作用靶点。以二妙散为基础方研制的风湿祛痛胶囊,能明显下调TNF-α诱导的MH7A 细胞、VEGF 诱导的HUVEC 细胞以及CIA 大鼠炎症关节滑膜组织中p38MAPK、ERK 和JNK的磷酸化表达水平,从体内和体外两个方面证实其可能通过抑制MAPK信号通路发挥治疗作用[32]。国医大师周仲瑛根据RA“阴虚络热证”的病机特点,采用养阴清热、宣痹通络法治疗,立清络通痹方。清络通痹颗粒通过WB 检测证实能够抑制RA 破骨细胞TRAF6、ERK1/2、p38MAPK、JNK 信号通路的活化[33]。民族医药对RA 的治疗有着丰富经验,壮医主张“毒虚致百病”,治疗上重视祛毒,辅以补虚,由飞龙掌血、大钻、八角枫、两面针、青风藤、九龙藤、五指毛桃和鸡血藤等壮药组成的龙钻通痹颗粒,能通过下调RA 模型大鼠滑膜中MEK1/2、ERK1/2mRNA 及蛋白表达水平,以减轻滑膜病变,延缓软骨和骨破坏[34]。从朱丹溪的痛风方中精简而来的新痹痛灵,能够下调EAM 大鼠滑膜组织中TLR4、NF-κB/p-p65 及P-p38MAPK 的蛋白表达,提示新痹痛灵可能是通过抑制TLR4/MAPK/NFκB 通路的异常活化来发挥治疗作用[35]。《伤寒论》中记载:“发汗,病不解,反恶寒者,虚故也,芍药甘草附子汤主之”。现代临床实践研究发现芍药甘草附子汤对RA疗效明确,石璐[36]通过实验证实,芍甘附子汤可下调CIA 大鼠关节滑膜ERK 和p38MAPK的磷酸化水平,证实其可能是通过抑制MAPK信号通路的异常活化,以发挥非特异性抗炎、镇痛作用。《医林改错》中记载身痛逐瘀汤可治疗痹症有瘀血者。HAN等[37]发现身痛逐瘀汤显著抑制RA-FLS中P-p38MAPK和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)蛋白及mRNA水平,促进过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR)γ蛋白及mRNA表达,以干预p38/PPARγ/CTGF 信号通路,并能抑制RA-FLS 增殖,诱导G1/S 期细胞阻滞并增加细胞凋亡率,从而改善RA病情。

3.3 中医物理治疗

中医物理治疗通过对特定部位、穴位的刺激,直接针对病灶,在治疗过程中具有靶向性高,起效快的独特优势。藏药浴疗法是藏医治疗RA 的常用手段,五味甘露颗粒对寒湿痹阻型RA 疗效显著。研究发现,五味甘露药浴散加减方在控制RA 的关节炎症状,缓解关节肿胀方面疗效确切,其机制可能为通过降低p38MAPK,ERK1/2 的蛋白表达以及JNK1、p38MAPK、ERK1 的基因表达,从而减少炎性因子的释放,抑制滑膜异常增殖,阻抑RA 关节骨质侵蚀[38]。通过基因芯片检测及生物信息分析技术证实,与模型组相比,艾灸双侧肾俞穴治疗后的RA 家兔滑膜细胞MAPK 通路上大量信号分子表达下调,说明艾灸的抗炎效应可能是对MAPK信号通路中相关信号分子表达的有效调控来实现的[39]。通过火针刺激L1~L5夹脊穴及阿是穴,可有效调节RA 模型大鼠滑膜组织JNK、p38MAPK 蛋白表达,降低MAPK 活性,从而参与抑制炎症细胞因子的转录,这可能是火针治疗RA起效的作用机制之一[40]。

4 展望

中医药以其多成分、多靶点、低毒性的特点在调控信号通路方面有着独特的优势。中药提取物及有效部位、中药复方、中医物理治疗均可以有效治疗RA。然而,国际上关于药物机制的研究已深入到分子机制层面。纵观相关中医药研究,大部分研究仅局限于临床疗效观察,对其作用机制研究不够深入。

目前关于MAPK 信号通路与RA 的实验研究报道众多,诸多研究发现,通过有效抑制MAPK 信号通路激活,可降低炎性因子的释放,改善关节炎的严重程度、减少骨破坏。关于MAPK 抑制剂的研发已成为RA 领域的研究热点。中医药的研究有望在多方面展开,进一步结合组学技术、表观遗传等新技术、新方法,将临床实践与基础研究有效衔接,通过人或动物的体内实验以及体外细胞实验,层层推进临床优势复方-单味中药-中药有效成分对RA 的作用机制,以期更好地解析中医药治疗RA的科学内涵。

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