电针干预对膝骨关节炎大鼠滑膜结构和SIRT1/HMGB1信号通路的影响*

黄文韬，李 冰△，陈 恒，李 武，李朵朵

(1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005，2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种涉及膝骨变性并累及周围组织(特别是滑膜组织)的退行性关节疾病，发病机制复杂，其中慢性低度炎症是驱动关节退化的主要原因之一[1]。随着人口老龄化的加剧，KOA在临床中的发病率逐年上升，发病率已经增加到45%，在老年人中高达80%，致残率约53%，严重影响人类的生活质量[2]。KOA的发生发展是一个长期慢性的不可逆过程，常采用保守治疗和手术治疗，尚无特效药，在传统中医中认为KOA病在筋骨，电针作为中医药的特色治疗法，已经被证实在KOA的保守治疗方面发挥良好的疗效，但作用机制尚不明确。临床KOA患者大多表现出明显的滑膜炎症，减少炎症介质(白细胞介素、肿瘤坏死因子)的积聚与释放，可以减轻KOA所致膝骨红肿、疼痛等症状，滑膜炎症可能是关节破坏的重要因素[3]。沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin，SIRT1)在滑膜细胞炎症反应中扮演重要角色，其高表达可降低高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和促炎因子的表达，增加滑膜细胞的寿命[4-5]。本研究在以往的研究基础上，以SIRT1激动剂为对照，探讨电针干预对KOA模型大鼠滑膜SIRT1/ HMGB1信号通路表达的影响，以期为临床治疗KOA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量约(200±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验生产许可证号[SCXK(湘)2019-0004]，在湖南省中医药研究院实验动物中心[SYXK(湘)2020-0008]饲养，实验程序根据湖南省中医药研究院实验动物中心管理规定进行，允许大鼠在恒定温度、湿度和光暗循环(20～25℃；55±10 %；12 h/12 h明暗光照循环，自由饮水和摄食。

1.2 实验试剂 SRT2104(批号：SC0272)，碧云天生物技术有限公司；IL-1β ELISA试剂盒(批号：E-EL-R0012c)、IL-6 ELISA试剂盒(批号：E-EL-R0015c)，Elabscience公司；SIRT1抗体(批号：60303-1-1g)，proteintech公司；HMGB1抗体(批号：66525-1-1g)，proteintech公司；HRP标记山羊抗大鼠(批号：G0001-2L)，Servicebio公司。SIRT1、HMGB1和β-actin引物，上海生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 SDZ-ⅡB型华佗牌电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司，中国)，Envision2105型酶标仪(PE公司)；ChemiDoc MP 型全能型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；ABI7500型实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)；DYY-6C型电泳仪(中国北京六一)；D3024R台式高速冷冻离心机(DRAGONLAB，中国)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备与分组[6]大鼠适应性喂养5 d后，随机分为正常组、模型组、电针组、SIRT1激动剂组(SRT2104，25mg/kg)，每组8只。除正常组外，其余各组参考文献诱导KOA模型：3%戊巴比妥钠(2 mg/kg)腹腔注射麻醉，分别在造模的第1、4、7 d，于左膝关节间隙处注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，然后按压1 min，来回屈伸关节使药液吸收，右膝不做处理。以Lequesne MG评分评估膝骨关节炎功能障碍程度，并判断造模是否成功。

1.3.2 干预方法 在模型复制成功后第3 d，将SD大鼠固定在鼠板上，参照《实验针灸学》[7]选取穴位位置：内膝眼、外膝眼、阴陵泉穴，采用华佗牌针0.25 mm×25 mm进行针刺，穴位深度3～5 mm，针柄处连接华佗牌SDZ-ⅡB型电子针疗仪，电流输出强度1 mA，疏密波型，刺激10 min/次，每日1次，连续14 d；对照组给予相同时间相同时长的固定。激动剂组[8]腹腔内注射SIRT1激动剂SRT2104溶液(采用10%DMSO生理盐水稀释至2.5 mg/mL，2 mL)，从实验第1 d开始，每周注射2次。正常组腹腔注射2 mL 10%DMSO生理盐水溶液。

1.3.3 行为学测试 Lequesne MG评分包括4个指标之和：①局部疼痛度(无疼痛0分，患肢收缩1分，收缩伴轻度全身反应2分，收缩伴重度全身反应3分)；②步态改变度(正常行走0分，轻度跛行1分，跛行明显2分，患肢不参与行走3分)；③关节肿胀度(无肿胀0分，轻度肿胀1分，重度肿胀2分)；④关节活动度(活动角度>90°0分，活动角度45°～90°1分，活动角度15°～45°2分，活动角度15°3分)。以此，评价膝骨关节炎损伤严重程度。

1.3.4 样本采集 行为学评估结束后，采用3%戊巴比妥(2 mg/kg)麻醉大鼠，大鼠膝骨关节处注入1 mL生理盐水收集大鼠膝关节滑膜液，-80℃保存待用；然后剖取膝骨关节滑膜组织，每组中4只浸泡于固定液(4%多聚甲醛)，保存待用；剩余组织置于冻存管中，保存于-80℃。

1.3.5 Elisa法检测膝关节滑膜液IL-1β和IL-6的含量变化 取冻存的关节滑膜液，梯度解冻后，将试剂盒平衡至室温，按照试剂盒说明书检测膝关节滑膜液IL-1β和IL-6的含量变化。

1.3.6 HE染色检测膝关节滑膜组织形态学变化 大鼠膝关节组织在固定液中固定15～20 d后，常规石蜡包埋，切片，制作成4 μm厚的石蜡切片，脱蜡、苏木素和伊红染色，封片，光学显微镜下观察膝关节滑膜组织形态学变化。

1.3.7 Western-blot法检测膝关节滑膜组织SIRT1和HMGB1表达变化 取冻存的膝关节滑膜组织100 mg，加入RIPA裂解液1 mL和100 μL PMSF溶液(1 mmol/kg)，低温匀浆，静置30 min，离心(12000 r，5 min，4 ℃)取上清液，采用核酸蛋白溶度仪测定总蛋白的浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，加入SIRT1和HMGB1蛋白和内参蛋白β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗孵育，ECL试剂显影，成像系统获取条带图像，Quantity One软件定量分析蛋白相对表达水平。

1.3.8 RT-PCR法检测膝关节滑膜组织SIRT1和HMGB1基因表达变化 取上述冻存的海马组织，加入1 mL Trizol，低温下匀浆，裂解5 min，提取样本总RNA，核酸蛋白测定仪定量。按照逆转录反应试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，反应条件为2× SYBR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL。扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，72 ℃ 2 min，40个循环。以GADPH为内参，反应结束后以2-ΔΔCt法计算分析目的基因SIRT1和HMGB1 mRNA相对表达水平。引物序列：SIRT1：Forward：5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCAA-3′，Reverse：5′-TGTCCGGGATATATTTCCTTTGC-3′，93bp；HMGB1：Forward：5′-GTCCACACACCCTGCATATTG-3′，Reverse：GTCCTCAGGTAAGGAGCAGAAC-3′，213bp；β-actin：Forward：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，Reverse：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，223 bp。

2 结果

2.1 电针对大鼠膝骨关节行为学的影响 各组大鼠造模后和治疗后Lequesne MG评分如表1所示，造模后，与正常组比较，其余各组大鼠左膝关节局部疼痛肿胀与活动度增加、步态改变显著，Lequesne MG评分总分明显升高(P<0.01)，提示模型复制成功。干预后，与模型组比较，电针组和SIRT1激动剂组可改善大鼠左膝关节肿胀与活动度、局部疼痛、步态，Lequesne MG评分总分明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠干预前后膝骨关节行为学比较

2.2 电针对大鼠膝骨关节滑膜液IL-1β和IL-6含量的影响 与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜液中IL-1β和IL-6含量明显增多(P<0.01)；与模型组比较，电针组和SIRT1激动剂组大鼠膝关节滑膜液中IL-1β和IL-6含量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.3 电针对大鼠膝骨关节滑膜组织形态病理学的影响 正常组大鼠膝骨关节滑膜上皮组织形态正常，滑膜细胞排列有序，无炎性细胞浸润；模型组大鼠膝骨关节滑膜上皮组织严重增生，滑膜细胞核大深染，排列不整齐，可见弥漫大量炎性细胞；电针组和激动剂组膝骨关节滑膜上皮组织轻微增生，滑膜细胞核染较浅，可见少量散在炎性细胞。

正常组

2.4 电针对大鼠膝骨关节滑膜组织SIRT1和HMGB1蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中SIRT1蛋白相对表达量明显降低，HMGB1蛋白相对表达量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，电针组和SIRT1激动剂组大鼠膝关节滑膜组织中SIRT1蛋白相对表达量明显增加，HMGB1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见图2，表3。

A.正常组 B.模型组 C.电针组 D.SIRT1激动剂组

表3 各组大鼠膝骨关节滑膜组织SIRT1和HMGB1蛋白相对表达量比较

2.5 电针对大鼠膝骨关节滑膜组织SIRT1和HMGB1mRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织中SIRT1mRNA相对表达量明显降低，HMGB1mRNA相对表达量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，电针组和SIRT1激动剂组大鼠膝关节滑膜组织中SIRT1mRNA相对表达量明显增加，HMGB1mRNA相对表达量明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠膝骨关节滑膜组织SIRT1和HMGB1mRNA相对表达量比较

3 讨论

膝骨关节炎在传统中医属于痹证范畴，称之为“骨痹”、“膝弊”等，与外感风寒湿邪和(或)年长体衰劳损等导致肝肾亏虚、经脉闭阻有关，治疗多从筋论治，调衡筋经阴阳气血、疏利关节[9]。针灸可通过经络、腧穴的传导作用内病外治，在临床治疗KOA中不仅可以有效调节疼痛中枢，改善微循环，还能避免药物治疗时的不良反应，提高了治疗的安全性[10]。位于膝关节之髕骨下两侧的内膝眼穴和外膝眼穴，具有“通经活络，消肿止痛”之功，再配以“清利湿热、益肾调经”的阴陵泉穴，在治疗KOA发挥良好的作用。本研究选取以上穴位，予以现代与传统相结合的电针刺激，明显改善大鼠膝关节肿胀、活动度、局部疼痛与步态。

KOA疾病早期即观察到滑膜的慢性炎症反应，其可导致血管形成增加、关节炎性浸润疼痛、肿胀僵硬等，抑制滑膜细胞增殖和炎性因子释放，可有效控制关节变形，减缓KOA病程。膝骨滑膜主要由内膜常驻巨噬细胞和成纤细胞构成，与下层血管化结缔组织等构成了滑膜液的主要成分，对于维持正常软骨和关节功能发挥重要作用[11]。SIRT1是一种NAD+依赖性III类蛋白脱乙酰酶，可抑制细胞代谢凋亡、炎症反应等，促进各类细胞存活。有研究发现，SIRT1参与KOA滑膜炎症发展，低表达能够导致促炎症因子的释放，增加血管裔的生成，减少软骨细胞的存活率[12]。此外，SIRT1激动剂能够减少Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型大鼠滑膜细胞中IL-1β的表达，有效缓解滑膜炎症[13]。

HMGB1是炎症反应的重要警报器，当机体受到炎症侵袭时，其赖氨酸残基乙酰化，然后释放至胞质或胞外参与炎症信号级联反应。临床研究显示，关节炎患者血清和滑膜液中HMGB1的表达明显升高，并与病情的发展成正相关，是关节软骨损伤的标志蛋白；HMGB1还能与IL-1形成复合体，促进KOA大鼠模型滑膜成纤维细胞释放相关促炎因子，并加速关节软骨的降解[14-15]。SIRT1是乙酰化/去乙酰化修饰的上游调节剂，可以通过去乙酰化作用调节HMGB1的释放，从而减弱炎症介质(IL-1β、IL-6等)的释放[16]。SIRT1过表达能够抑制脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞HMGB1乙酰化和核质易位[17]。SIRT1新型激动剂SRT2104，能减轻葡聚糖硫酸钠(DDS)诱导的结肠炎模型中的炎症，还能显著减弱LPS诱导的IL-6释放[18]。

本研究选用激动剂SRT2104和电针干预KOA大鼠模型，发现其能有效改善滑膜炎性浸润和损伤，减少滑膜液中炎性因子(IL-1β和IL-6)的释放，调控滑膜组织中SIRT1和HMGB1蛋白基因的相对表达，因此，我们有理由认为SIRT1/ HMGB1信号通路在KOA的发生与发展中扮演重要角色。电针作为一种绿色疗法已经在临床KOA的治疗效果中被肯定，本研究为其提供更加科学和深入的理论支撑。