玛咖保肝通便及调节肠道菌群的作用研究

李宗源 陈红映 于泽玥 郝莉雨 孙建辉 李洪梅 陈 敏

(1 江苏大学药学院，镇江，210023； 2 中国中医科学院，北京，100700； 3 琼海市中医院，琼海，571499； 4 中国中医科学院中药研究所，北京，100700； 5 中国中医科学院中药资源中心，北京，100700)

玛咖(LepidiummeyeniiWalper，Maca)属于十字花科独行菜属植物，能极好地适应极端恶劣的高海拔条件，主要生长在海拔2 800～5 000 m的地方，如秘鲁的安第斯山脉的中部地区，是安第斯山脉唯一的十字花科植物[1]，玛咖在秘鲁是一种传统的粮食作物，可种植，且全株均可食用[2]。玛咖的药用部位主要是下胚轴，且下胚轴主要有13种颜色，其中黑色、黄色、红色应用较为广泛，其下胚轴被作为功能性食品或药物在全球广泛使用[3]。玛咖在2011年被我国批准为新资源食品[4]。玛咖不但含有丰富的多糖、鞣质、脂肪油、支链氨基酸等成分，还含有一些次生代谢物，如芥子油苷、玛卡酰胺、玛咖烯、黄酮类、萜类、甾醇类化合物等[5]，具有抗疲劳[6]、促进性欲[7]、抑制前列腺增生[8]、降血糖和降血脂[9]、抗骨质疏松[10]、提高记忆力[11]、提高免疫力[12]、抗氧化[13]、治疗皮肤损伤[14]等作用。

在人们日常生活中，乙醇饮品的销量日益增高，这种现象同时伴随着疾病的产生，如酒精性肝损伤(Alcoholic Liver Disease，ALD)，ALD是一种由急性或慢性饮酒引起的肝脏代谢紊乱，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，严重危害人类健康[15]。据研究报道，玛咖多糖能减轻乙醇对人肝细胞癌(Human Hepatocellular Carcinomas，HCC)HepG2细胞的损伤[16]；玛咖醇提物可以改善刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)诱导的急性肝炎[17]。胃肠动力作为消化系统中一项重要的功能，其发生疾病的概率在近年来不断增加，中医认为，脾胃虚弱、气机升降失调是胃肠动力障碍性疾病发生的主要病机[18]。研究发现，玛咖地上部分能提高小鼠血清胃动素(Motillin，MTL)、促胃液素(Gastrin，GAS)，从而促进小鼠胃排空和小肠推进[19]。其他相关文献对玛咖治疗、促进胃肠道功能报道甚少。在人的平均寿命中，大约有60吨食物通过人体胃肠道，同时环境中大量的微生物对肠道的完整性构成了巨大的威胁，而在胃肠道定居的细菌、古菌和真核生物的集合称为“肠道微生物群落”[20]，肠道菌群是人体中最大的消化器官，包括双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等[21]，几千年来它们与宿主共同进化，形成了一种错综复杂的互惠关系。目前未见玛咖水提液对ALD、胃肠运动、肠道菌群影响的相关性报道。因此，作者通过ALD模型、胃肠动力障碍模型、正常动物，评价玛咖水提液的保肝、通便、调节肠道菌群作用，为扩大玛咖应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级ICR小鼠，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。饲养于中国中医科学院中药研究所动物室，为屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2019-0003。本研究通过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会审批(伦理审批号为：2020B072)

1.1.2 药物 黑玛咖(会泽枢康中草药种植有限公司)；联苯双酯滴丸(北京协和药厂，批号：19120)；麻仁润肠丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：19015139)。

1.1.3 试剂与仪器 无水乙醇(分析纯)(国药集团化学试剂有限公司，批号：20181210)；盐酸洛哌丁胺(SIGMA公司，美国，批号：127M4884V)；活性炭粉(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190702)；阿拉伯树胶(solarbio公司，批号：1010H021)；谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase，GPT)(北京安图生物工程有限公司，批号：01112D11)；谷草转氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase，GOT)(北京安图生物工程有限公司，批号：01015C11)；碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)(北京安图生物工程有限公司，批号：01103C11)；TransStartFastpfu DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司，批号：AP221-02)；总蛋白定量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20201022)；谷胱甘肽(Glutathione，GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20201019)；小鼠肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附试验试剂盒(cloud-clone公司，美国，批号：L201201225)；小鼠单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein 1，MCP-1)酶联免疫吸附试验试剂盒(cloud-clone公司，美国，批号：L201203406)；小鼠MTL酶联免疫试吸附试验剂盒(cloud-clone公司，美国，批号：L201224496)；环磷酸鸟苷(Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP)试剂盒(cloud-clone公司，美国，批号：L210212978)；EZNA Stool DNA Kit粪便DNA提取试剂盒(OMEGA公司，美国，批号：D4015-02)；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司，美国，批号：AP-GX-250)；冷冻离心机(KUBOTA公司，日本，型号：5922)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：BSA3202S-CW]；电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：PL203]；全自动生化分析仪(东芝公司，日本，型号：TBA-120FR)；酶标仪(Bio Tek Instruments，Inc，美国，型号：Epoch)；电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司，型号：98-I-B)；中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司，型号：FW177)；CO2培养箱(SANYO Electric Co.，Ltd，日本，型号：MCO-15AC)；电热三用水箱(北京医疗设备厂有限责任公司，型号：BDS260)；基因扩增仪(ABI公司，美国，型号：GeneAmp970)；测序仪(Illumina公司，美国，型号：Illumina MiSeq)；蓝色荧光定量系统(Promega公司，美国，型号：QuantiFluor-ST)。

1.2 方法

1.2.1 玛咖对小鼠ALD保护作用的研究

1.2.1.1 分组及模型制备 选取ICR小鼠71只，SPF级，雄性，体质量18～22 g，自由饮水和饮食，动物在屏障环境饲养，湿度为：40%～70%，温度为22～27 ℃。小鼠适应性饲养后，按体质量随机分组，分别为正常组、模型组、联苯双酯滴丸组(0.006 g/kg)、玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量剂量组(6.50 g/kg、3.25 g/kg、1.63 g/kg)，每组12只。每天灌胃给予相应受试物，正常组和模型组灌胃等量的纯净水(20 mL/kg)，连续14 d，末次药后2 h，除正常组外，模型组和其他受试组单次灌胃给予18 mL/kg、50%乙醇造模，禁食不禁水12 h后进行标本采集和指标检测。

1.2.1.2 给药方法 玛咖水提液的制备[22]：将玛咖切片粉碎成粗粉，称取粗粉200 g放入圆底烧瓶，加入4 L纯净水，置电热套中加热，保持微沸100 min，过滤，滤液水浴浓缩(70 ℃)，得生药质量浓度为1 g/mL的水提液，4 ℃保存，临用前稀释至0.32 g/mL、0.16 g/mL、0.08 g/mL。正常组和模型组灌胃等量的纯净水(20 mL/kg)，其余各组给予相应受试物灌胃，连续14 d。

1.2.1.3 检测指标与方法 1)样本采集：小鼠禁食不禁水12 h后，摘眼球取血，4 ℃中放置2 h，离心(1 710×g，15 min)，分离血清，-20 ℃保存。取血后，将小鼠颈椎脱臼处死，摘取肝脏，称肝重，将肝在液氮速冻后置于-20 ℃保存。2)小鼠肝功能指标检测：采用TBA-120FR全自动生化分析仪，检测小鼠血清中GPT、GOT、ALP的含量。3)小鼠炎症指标检测：按照酶联免疫吸附试剂盒说明书操作，检测小鼠2%肝匀浆中MCP-1和小鼠血清中TNF-α的含量。4)小鼠脂质过氧化指标检测：按照试剂盒说明书操作，检测小鼠10%肝匀浆中GSH的含量。

1.2.2 玛咖通便功能的研究

1.2.2.1 分组与模型制备 选取ICR小鼠50只，SPF级，体质量18～22 g，自由饮水和饮食，动物在屏障环境饲养，湿度为：40%～70%，温度为22～27 ℃。小鼠适应性饲养后，按体质量随机分组，分别为正常组、模型组、麻仁润肠丸组(6.24 g/kg)、玛咖水提液高、中剂量组(6.50 g/kg、3.25 g/kg)，每组10只。每天灌胃给予相应受试物1次，正常组和模型组灌胃等量的纯净水(20 mL/kg)，连续给药9 d。测定小肠推进率前各组小鼠禁食不禁水16 h，正常组灌胃给予纯净水，其余各组灌胃给予盐酸洛哌丁胺混悬液10 mg/kg造模。

1.2.2.2 给药方法 造模30 min后，各组分别灌胃给予含相应受试样品的墨汁溶液(含5%活性炭粉、10%阿拉伯树胶)，正常组和模型组灌胃墨汁溶液。给药25 min后摘眼球取血，4 ℃中放置2 h，离心(1 710×g，15 min)，分离血清，-20 ℃保存。

1.2.2.3 检测指标与方法 脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，计算小肠推进率(%)=墨汁推进度/小肠总长度×100%。

1.2.3 玛咖调节肠道菌群功能的研究

1.2.3.1 动物分组 选取ICR小鼠50只，SPF级，雄性，体质量18～22 g，自由饮水和饮食，动物在屏障环境饲养，湿度为40%～70%，温度为22～27 ℃。小鼠适应性饲养后，按体质量随机分组，分别为空白组、模型组、麻仁润肠丸组(6.24 g/kg)、玛咖水提液高剂量、中剂量组(12.6 g/kg、8.4 g/kg)，每组10只。

1.2.3.2 给药方法 给予各组相应浓度玛咖水提液灌胃，体积为20 mL/kg，连续给药30 d。末次给药后30 min脱颈椎处死小鼠，无菌条件下取盲肠内容物，液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2.3.3 检测指标与方法 1)肠道内容物DNA提取、16S rDNA扩增及测序：按DNA提取试剂盒说明书提取盲肠内容物DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。对盲肠内容物提取的DNA进行PCR扩增，本实验选用的扩增引物为338F-806R，其中338F序列为5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R序列为5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。使用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的产物。选取450 bp左右的条带，凝胶回收试剂盒回收扩增产物。用Tris-HCl洗脱收集回收后的扩增产物，定量后按比例混合不同样品的扩增产物。通过PCR将接头连接到混合好的样品DNA上，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。再用1% NaOH溶液将产物变性为单链，完成文库构建。利用Miseq平台对文库进行高通量测序。2)生物信息分析：使用FLASH进行数据质量控制；OTU(运算分类单元)聚类使用Usearch，按照99%相似度进行聚类；使用QIIME2(微生物生态学定量分析)进行物种注释及weighted-UniFrac矩阵,数据库为Silva(Release128，https://www.arb-silva.de),使用LEfSe(线性判别分析效应尺寸)方法对属水平进行丰度显著差异分类单元筛选，判别标准为：Kruskal-Wallis检验筛选值α<0.05，配对Wilcoxon检验筛选值α<0.05，显著判别值LDA>2。

2 结果

2.1 玛咖对小鼠ALD保护作用的研究

2.1.1 小鼠肝功能指标 正常组和联苯双酯滴丸组分别有一只动物意外死亡。与正常组比较，模型组小鼠血清中GPT、GOT、ALP含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，玛咖水提液中剂量能明显降低小鼠血清中GPT、GOT的含量(P<0.05)，低剂量能明显降低小鼠血清中ALP的含量(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 玛咖对小鼠肝功能指标的影响

2.1.2 小鼠炎症指标 与正常组比较，模型组小鼠血清中TNF-α含量明显增加(P<0.05)；与模型组比较，玛咖水提液高、中剂量能明显降低小鼠血清中TNF-α的含量(P<0.05或P<0.01)。见表2。与模型组比较，玛咖水提液高剂量、低剂量能明显降低小鼠肝脏组织中MCP-1的含量(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表2 玛咖对小鼠血清中炎症介质含量的影响

表3 玛咖对小鼠肝组织中炎症介质含量的影响

2.1.3 小鼠脂质过氧化指标 与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织中GSH含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量剂量均能明显升高小鼠肝脏组织中GSH的含量(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 玛咖对小鼠肝脏组织中脂质过氧化指标的影响

2.2 玛咖通便功能的研究

2.2.1 玛咖对小鼠小肠推进率的影响 与正常组比较，模型组小鼠小肠推进率明显减小(P<0.001)，表明小鼠小肠运动抑制模型造模成功；与模型组比较，玛咖水提液高剂量能明显增加小鼠小肠推进率(P<0.05或P<0.01)。见表5。

表5 玛咖对小鼠小肠推进率的影响

2.2.2 玛咖对小鼠血清中MTL和cGMP的影响 与模型组比较，玛咖水提液中剂量组能明显增加小鼠血清中MTL的含量(P<0.05)，同时，玛咖水提液能降低cGMP水平。见表6。

表6 玛咖对小鼠血清中MTL和cGMP的影响

2.3 玛咖调节肠道菌群功能的研究

2.3.1 物种注释及评估 通过Pan/Core物种分析得出：随着样本量的增加，Pan物种增加，并趋于平缓，Core物种减少，并趋于平缓，表明本次实验小鼠的样本量足够，可信度高。见图1。通过样本Alpha多样性分析，simpson指数反映微生物群落物种多样性，玛咖水提液中剂量组simpson指数高于空白组。见图2。

2.3.2 物种组成分析 小鼠肠道菌群的群落结构在门水平上，丰度较高的菌群为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，其中Firmicutes与Bacteroidetes占绝对优势。与空白组比较，玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量剂量减少了Firmicutes的丰度；玛咖水提液高剂量、低剂量增加了Bacteroidetes的丰度。见图3。在属水平上，乳杆菌属(Lactobacillus)和拟杆菌属(norank_f__Bacteroidales_S24-7_group)的丰度占绝对优势。其他丰度较高的菌群依次为毛螺菌属(norank_f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f__Lachnospiraceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和拟普雷沃菌属(Alloprevotella)。与空白组比较，玛咖水提液中剂量增加了Lactobacillus的丰度；玛咖水提液中剂量、低剂量增加了Alloprevotella的丰度。见图4。不同样本中物种(属水平、OTU水平上)组成相似性及重叠情况通过韦恩图直观展现。见图5。

2.3.3 小鼠肠道微生物群落结构的变化情况 基于Beta多样性分析中的PcoA分析表明，在OTU分类水平上，空白组与玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量组的肠道微生物群落有显著性差异。基于weighed-UniFrac矩阵的PerMANOVA分析同样得到：在OTU水平，空白组与玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量组间物种组成存在一定差异。见图6，表7。

表7 与空白组比较小鼠肠道微生物群落结构差异(n=10)

2.3.4 物种差异分析 利用LEfSe方法在属水平上筛选空白组与玛咖水提液组小鼠中丰度变异的肠道菌。与空白组比较，玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量组变化趋势一致且相对丰度大于0.01%，即被认为丰度显著差异分类单元。经Kruskal-Wallis秩和检验，获得组间显著性差异物种。差异显著的物种有脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、颤螺旋菌属(Oscillibacter)、气球菌属(Aerococcus)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、产丁酸菌属(Alistipes)、消化球菌(norank_f__Peptococcaceae)、瘤胃球菌属(norank_f__Ruminococcaceae)、普雷沃氏菌属(Prevotellaceae_UCG-001)、硬壁菌属(unclassified_p__Firmicutes)、真杆菌属(Eubacterium_brachy_group)、unclassified_f__Coriobacteriaceae、Family_XIII_UCG-001。与空白组比较，玛咖水提液高剂量、低剂量能明显增加Alistipes的丰度(P<0.05)；玛咖水提液中剂量能明显降低Desulfovibrio、Eubacterium_brachy_group的丰度(P<0.01)；玛咖水提液低剂量能明显降低Desulfovibrio、norank_f__Peptococcaceae的丰度(P<0.01)。见图7～8。

2.3.5 代谢功能预测 使用PICRUSt软件进行功能预测，与空白组比较，玛咖水提液高剂量组RNA加工和修饰、细胞运动、细胞外结构、细胞骨架项降低，其他代谢功能升高；玛咖水提液中剂量组细胞运动、细胞骨架项降低，其他代谢功能升高；玛咖水提液低剂量组仅RNA加工和修饰、细胞外结构、细胞骨架项降低，其他代谢功能升高。见图9。

3 讨论

GPT、GOT、ALP是血清中评价肝脏功能的重要标志性因子，从小鼠肝功能指标结果来看，用18 mL/kg、50%乙醇造模后，与正常组比较，模型组小鼠血清中GPT、GOT、ALP含量增加，表明造模成功，与模型组比较，玛咖水提液中剂量组能明显降低小鼠血清中GPT、GOT的含量，玛咖水提液低剂量组能明显降低小鼠血清中ALP的含量。

ALD的病理变化包括脂肪肝、肝炎、肝纤维化和肝硬化，最后到肝癌，脂肪肝是ALD的最早反应[23]，乙醇能诱导肝细胞色素P450 2E1(Cytochrome P450 2E1，CYP2E1)，CYP2E1的氧化导致活性氧的过度产生，由此导致氧化应激[24]，引发脂肪酸β-氧化出现障碍，肝脏内大量游离脂肪酸(Free Fat Acid，FFA)出现堆积，导致肝脏代谢紊乱。本研究发现，玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量剂量均能明显升高小鼠肝脏组织中GSH的含量。玛咖水提液高剂量、中剂量能明显降低小鼠血清中TNF-α的含量，玛咖水提液高剂量、低剂量组能有效降低ALD小鼠肝组织中MCP-1的含量。上述结果显示玛咖对ALD小鼠的肝功能、脂质过氧化及炎症具有保护作用。

玛咖通便功能的研究结果显示，玛咖能通过增加MTL分泌和抑制cGMP的生成，从而增加小鼠的小肠推进率。MTL主要由小肠中的Mo细胞分泌，主要分布于十二指肠近端和空肠的隐窝以及垂体前叶、松果体、大脑皮质、小脑和下丘脑等神经组织，能改善小肠的运动，MTL是通过增加结肠运动来促进胃肠内容物运动的一种重要因子[25]。它能够提高胃肠道的收缩力和张力[26]，增加平滑肌收缩和胃蛋白酶分泌，促进胃排空及促进消化等[27-28]。

cGMP是细神经系统调节胃肠运动中细胞内一种重要的第二信使，是调节平滑肌的重要因素，平滑肌细胞中cGMP含量升高，使细胞中Ca2+浓度降低，引起平滑肌舒张[29-30]。玛咖减少cGMP生成，可能通过抑制sGC(可溶性鸟苷酸环化酶)/cGMP、CNP(C型利尿钠肽)/cGMP信号通路，从而改善小鼠胃肠动力障碍。

小鼠肠道菌群的微生物群落结构分析表明，在门水平上，玛咖水提液高剂量、中剂量、低剂量剂量降低了小鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度；玛咖水提液高剂量、低剂量增加了拟杆菌门相对丰度。在属水平上，玛咖水提液中剂量提高了乳杆菌属相对丰度，玛咖水提液中剂量、低剂量增加了拟普雷沃菌属的相对丰度。

拟杆菌门是肠道菌群中的有益菌，其在肠道菌群的比例为15%～90%，而厚壁菌门在肠道菌群的比例为70%～5%[31]。有研究发现厚壁菌门多于拟杆菌门时会高效吸收热量导致肥胖[31]，因此，玛咖能否通过调节肠道菌群从而达到减肥的效果，这需要进一步的实验来证明。乳杆菌属作为肠道菌群中的一种有益菌属，具有调节肠道，降低胆固醇，增强免疫力的功能[32]。如拮抗肠球菌和白色念珠菌等有害菌，对提高抗菌疗法的疗效[33]、减轻肠易激综合征症状[34]、抗高血糖活性、治疗糖尿病等具有积极作用[35]。拟普雷沃菌属具有降解多种植物多糖的能力，它在消化富含碳水化合物的食物中起关键作用[36]。以上表明玛咖可能通过调节肠道菌群来增加乳酸菌属和拟普雷沃菌属的相对丰度，从而促进胃肠蠕动。

综上所述，玛咖水提液对ALD小鼠的肝功能、脂质代谢异常、过氧化及炎症具有保护作用，可促进胃肠运动，调节肠道菌群，为扩大玛咖应用提供了参考，其作用机制有待进一步研究。