小檗碱对喉癌细胞克隆、转移及Toll样受体4蛋白的作用

李 娜 张 颖 李芳园 焦培英 张 义 王文娟

(1 哈励逊国际和平医院，衡水，053000； 2 河北工程大学，邯郸，056038)

喉癌是发生在声门部位及其周围的组织，多数为原发性的头颈部恶性癌症，由于生活习惯的改变、工作环境、空气污染等因素导致喉癌的发病率呈现逐年上升的态势[1]。喉癌患者中男性所占比重较大，研究证明喉癌患者体内的睾酮含量较健康人体高[2]，喉癌细胞能够通过对附近组织的浸润和转移，现有的喉癌治疗方法有手术、放疗、化疗和生物治疗等多种方式[3]。虽然喉癌治疗方案已逐步改良，但是这些治疗方法存在一定的缺点，例如：口干、味觉与嗅觉灵敏度下降等不良反应，因此，需要寻找一种不良反应较小的药物进行治疗至关重要。近几年，中药逐渐应用于肿瘤的治疗，因其有害成分比较少、对声门部位损害小、疾病药效稳定等多种原因被广泛应用。小檗碱是在中药黄连中提炼出的一种味极苦的黄色针状结晶性的季铵生物碱粉末[4]。它能够有效地治疗多种疾病，如胃肠炎、化脓性中耳炎及恶性癌症等。近年来临床研究实验证明小檗碱能够增强白血球吞噬作用，能够有效抑制细菌的大量繁殖[5]。但关于小檗碱对喉癌细胞的进行研究的相关文献较少，在此基础上本研究采用不同浓度的小檗碱对喉癌细胞进行干预，分析其对喉癌细胞克隆、转移及Toll样受体4蛋白的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养、分组及处理 将小牛血清在57 ℃的环境下灭活30 min，在RPMI1640培养基中接种含10%小牛血清的喉癌细胞，在37 ℃，5% CO2培养，细胞聚合90%时，按照1∶3传代，研究选取指数增长期的癌细胞。在25 mL的培养瓶中加入不同剂量的小檗碱分为4组，空白对照组(喉癌细胞正常培养)，5 μmol/L小檗碱干预组(喉癌细胞培养基中加入5 μmol/L小檗碱)，10 μmol/L小檗碱干预组(喉癌细胞培养基中加入10 μmol/L小檗碱)，20 μmol/L小檗碱干预组(喉癌细胞培养基中加入20 μmol/L小檗碱)。

1.1.2 药品与试剂 喉癌细胞株(Hep2)(上海抚生实业有限公司，货号：FS-0255)；小檗碱(上海惠诚生物科技有限公司，货号：025-17181)；细胞培养基[赛百慷(上海)生物技术股份有限公司]；Toll样受体4抗体、Toll样受体2抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司，货号：PL0305463、OL0305461)；胎牛血清(内蒙古奥普赛生物科技有限公司，货号：BS-1107-500 mL)；磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)(广州环凯生物科技有限公司，货号：022117)；结晶紫染色液(背景索莱宝科技有限公司，货号：G1061-500)。

1.2 方法

1.2.1 细胞克隆形成实验 选取对数生长期的喉癌细胞，将其消化为单细胞，进行活细胞计数实验。将其密度调整为1×106细胞/L，加入5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的小檗碱。进行高温杀菌后，为使其保持液体状态将温度保持在36 ℃左右，模拟生理环境，在5%CO2中培养14 d，克隆喉癌细胞，甲醛固定15 min，用结晶紫染色液，在37 ℃的CO2温箱中培养24 h、48 h、72 h。把培养皿用仪器观察，利用公式测算细胞克隆情况。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.2 蛋白质印迹法(Western Blotting)检测Toll样受体4、Toll样受体2蛋白水平 将5×103细胞/mL各组喉癌细胞0.125%胰蛋白酶消化，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，300×g，取上清液，检测蛋白浓度，每孔加样20 μg蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转面膜后取上清液以BAC法检测蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(每孔加样20 μg蛋白)，转膜后在含50 g/L脱脂奶粉的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)，室温封闭1 h后，洗涤缓冲液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗膜，转膜后加入脱脂奶粉(50 g/L)、缓冲液，室温封闭1 h，再次洗膜，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL发光，Image J软件对蛋白灰度值进行计算。

1.2.3 MTT(噻唑蓝)法检测细胞增殖 取对数生长期的喉癌细胞，加入蛋白酶消化，按照细胞数量5×104接种到96孔板，放置于37.4 ℃、5%CO2培养，每组设置6孔，培养0 h，24 h，48 h及72 h后，加入100 μL 10%的CCK-8培养基，按照常规进行噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5 diphenyhetrazolium bromide，MTT)实验，继续培养3.5 h后，利用酶标仪480 nm下计算细胞活力，细胞存活率=小檗碱组D值/空白对照组D值×100%。各设3个复孔进行实验。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移情况 将对数生长期的喉癌细胞取出，进行消化收集，接种在96孔板中，4组细胞铺设范围达到90%时，用10 μL无菌枪尖划痕，用PBS清洗细胞3次，清除破损细胞；记录0 h和24 h时划痕的大小，进行拍照。划痕闭合率(%)=(24 h划痕宽度-0 h划痕宽度)×100%。

1.2.5 流式法检测细胞凋亡 将4组的细胞培养72 h后，进行收集，PBS清洗2次，再用75%预冷乙醇40 ℃固定过夜，随后用PBS洗涤，并重悬于含0.1 mg/mL的碘化丙啶中，室温避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 小檗碱对喉癌细胞克隆形成率的影响 4组喉癌细胞在24 h、48 h及72 h时克隆形成率比较差异均有统计学意义(F24 h=3.469，F48 h=20.590，F72 h=30.691，均P<0.05)。在24 h时，空白对照组的细胞克隆形成能力与5 μmol/L小檗碱干预组相似(P>0.05)，空白对照组的细胞克隆能力较10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组高(P<0.05)；在48 h和72 h时，与空白对照组比较，其他加入小檗碱进行干预的3组细胞克隆形成率均有明显下降(P<0.05)。且20 μmol/L小檗碱干预组的克隆形成率明显低于10 μmol/L小檗碱干预组、5 μmol/L小檗碱干预组(P<0.05)，随着小檗碱作用时间延长、浓度升高，喉癌细胞克隆形成率逐渐减弱。见表1，图1。

表1 各组喉癌细胞不同时间段克隆形成率比较

2.2 小檗碱对喉癌细胞中Toll样受体2、Toll样受体4表达的影响 与空白对照组细胞中Toll样受体2及Toll样受体4表达比较，5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组均有所降低(P<0.05)，与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组细胞中Toll样受体2及Toll样受体4蛋白表达均下降(P<0.05)，随着小檗碱浓度的升高，Toll样受体2与Toll样受体4蛋白表达降低，小檗碱可抑制Toll样受体2与Toll样受体4蛋白活性。见表2，图2。

表2 各组喉癌细胞中Toll样受体2和Toll样受体4蛋白表达比较

2.3 小檗碱对喉癌细胞增殖的影响 给药24 h、48 h、72 h后，与空白对照组比较，5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组细胞增殖率均有所降低(P<0.01)；与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组细胞的增殖率有明显的下降趋势(P<0.05)，且给予小檗碱干预3组喉癌细胞增殖率依次递减，随着小檗碱作用时间延长，喉癌细胞增殖率逐渐降低，小檗碱可抑制喉癌细胞增殖。见表3，图3。

表3 各组喉癌细胞增殖率情况

2.4 小檗碱对喉癌细胞划痕距离的影响 24 h空白对照组、5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组喉癌细胞划痕距离分别为(21.32±4.37)μm、(17.87±3.43)μm、(14.65±3.26)μm、(9.84±2.13)μm，与空白对照组比较，5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组在24 h时喉癌细胞划痕距离均有所下降(P<0.05)。与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组喉癌细胞划痕距离缩短(P<0.05)，随着小檗碱作用时间延长，喉癌细胞划痕距离逐渐缩短。见图2。

2.5 小檗碱对喉癌细胞凋亡的影响 48 h后空白对照组、5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组喉癌细胞凋亡率分别为(3.97±0.52)%、(7.36±0.63)%、(11.49±1.04)%、(19.83±2.38)%，与空白对照组比较，其余3组的喉癌细胞凋亡率逐渐升高(P<0.05)，与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组喉癌细胞凋亡率均有所升高(P<0.05)，随着小檗碱作用时间延长，喉癌细胞凋亡率逐渐升高，说明小檗碱可促进喉癌细胞凋亡。见图5。

3 讨论

喉癌是喉黏膜上皮组织病变所造成鳞状细胞癌，多发生在中国北部[6]。主要的诱发因素是烟酒刺激、饮食等，严重情况下喉部表面会出现恶臭气味，以现有的医学水平尚缺乏治疗喉癌的靶向药物，因此寻找不良反应较小且疗效较好的中药是关键的一步。在现代医疗中研究表明中药具有抗癌作用，利用其有效成分抑制癌细胞的生物活性可达到改善癌症之功效[7]。小檗碱是一种从黄连中提炼而成的能够治疗心律失常及细菌性胃肠炎的药物，有关报道提出小檗碱能够阻碍癌细胞的迅速增殖，但是关于不同浓度小檗碱对喉癌细胞克隆、转移与Toll样受体4蛋白表达的研究较少[8]。

本研究发现空白对照组喉癌细胞增殖、克隆能力高于其他3组，细胞凋亡率低于其他3组，与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组喉癌细胞克隆能力及增殖均减低，细胞凋亡率升高，且随着小檗碱作用时间越长，效果更佳，说明小檗碱可抑制喉癌细胞增殖、克隆，促进细胞凋亡。当声门部位血管发生损伤或者发生其他病理疾病，小檗碱能够有效改善其炎症的发生[9]。闫波等[10]指出形成克隆的细胞具有增殖活性，小檗碱能够有效抑制克隆细胞的形成，从根本上降低癌细胞活性。这一结论与本研究结果相似。喉癌细胞的转移是由多因素多路径共同作用的结果，Ren等[11]研究发现，小檗碱能够有效减弱黑色素癌细胞中神经钙黏素的表达,从而达到癌细胞的迁移速率降低的目的。谢天飞等[12]学者通过离体实验对Hep2细胞增进行研究，结果表明与空白空白对照组比较，小檗碱组Hep2细胞生活活性降低，侵袭数量减少，其作用机制与调控P磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、p-蛋白激酶B表达水平有关，抑制细胞中血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9活性，从而促进Hep2细胞凋亡。小檗碱是小檗科植物中提取的一种含有氮杂环的季铵型生物碱，能发挥较好的抗炎、抗炎效果，可通过抑制蛋白、DNA的合成来抑制肿瘤的发生发展[13]。研究发现小檗碱抑癌作用在于阻滞细胞生长周期，使癌细胞停滞在G0/G1期[14]。有学者通过巨噬细胞与癌细胞共培养给予小檗碱干预，结果表明小檗碱可通过降低巨噬细胞来抑制癌细胞的活性[15]。邢天娇等[7]学者通过建立皮肤鳞状细胞癌大鼠模型给予小檗碱腹腔注射，结果表明，与空白对照组比较，小檗碱干预组裸鼠移植瘤细胞凋亡数量增加，凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低，其作用机制与上调Bax、胱天蛋白酶-3水平有关[7]。多项研究表明小檗碱具有抗癌机制，可抑制肿瘤相关蛋白和酶的活性、阻断钾离子通道、降低炎症反应，抑制肿瘤细胞的活性，同时小檗碱还可以提高肿瘤细胞对顺铂敏感性，达到抗肿瘤的结果[4,8,10]。

本研究表明，与空白对照组细胞中Toll样受体2及Toll样受体4蛋白表达比较，5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组、20 μmol/L小檗碱干预组均有所降低，与5 μmol/L小檗碱干预组、10 μmol/L小檗碱干预组比较，20 μmol/L小檗碱干预组细胞中Toll样受体2及Toll样受体4蛋白表达均下降，随着小檗碱浓度的升高，Toll样受体2与Toll样受体4蛋白表达降低，说明小檗碱可抑制Toll样受体2与Toll样受体4蛋白活性。Toll样受体是一类参与天然免疫的跨膜蛋白，通过树突状细胞、中性粒细胞等进行表达，当出现损伤肌体时，它激活免疫细胞应答，在免疫中发挥主要作用[16]。Toll样受体2、Toll样受体4是Toll样受体中受体之一，Toll样受体4与肿瘤的发生和发展有密切的关系，在多种肿瘤中如非小细胞性肺癌、甲状腺癌、口腔癌等均异常表达[17-18]。王志平等[19]研究表明，发现爪蟾驱动蛋白样蛋白的靶向蛋白(Targeting Protein for Xenopus Kinesin-like Protein 2，TPX2)、Toll样受体4在癌组织中的表达高于癌旁组织，TPX2在癌细胞中的过表达，可控制细胞的有丝分裂，下调TPX2可调控纺锤体微管相关蛋白进而导致癌细胞的周期紊乱，使其增殖能力下降。Toll样受体4可由局部内源性酶激活，可调控炎症及信号转导、细胞死亡，Toll样受体4转导免疫反应是炎症疾病的起点，会引起病毒性炎症病变。有研究表明炎症介质最先转入细胞膜中，与细胞膜受体(如Toll样受体4等)结合，诱发炎症反应，促进肿瘤细胞免疫逃逸，促进肿瘤发展[19-20]。蔡静等[21]通过体外细胞实验研究发现沉默Toll样受体4信号可抑制宫颈癌增殖，穿膜细胞数明显减少，降低Myd88,胞外信号调节激酶1/2及核因子κB蛋白的活性，从而抑制宫颈癌细胞的迁移及侵袭。熊莺等通过对膀胱癌细胞进行实验发现Toll样受体2信号通路参与膀胱癌细胞免疫逃逸，其作用机制与上调血管内皮生长因子和TGF-β1信号通路有关[22]。有学者通过对Hela细胞进行体外研究发现，不同剂量小檗碱干预的HeLa细胞，其增殖、迁移数量均降低，其作用机制与通过抑制p65、Bcl-2和Toll样受体4表达水平来实现[23]。这与本研究结果相似，小檗碱通过调控TPX2、Toll样受体4信号通路从而抑制喉癌细胞生物活性。

综上所述，不同浓度小檗碱均可降低喉癌细胞克隆、增殖及迁移能力，其作用机制可能通过抑制Toll样受体2、Toll样受体4蛋白活性从而促进喉癌细胞凋亡。