蒺藜中螺甾总皂苷和呋甾总皂苷抑制酪氨酸酶活性对比研究

王文姣

（吉林工业职业技术学院制药与环境技术学院，吉林 吉林 132013）

1 引言

酪氨酸酶是一种含铜的金属酶，广泛存在于动植物、微生物以及人体中。由于酪氨酸酶的表达水平和活性能够决定黑色素合成的速度和产量，在黑色素形成过程中具有重要作用，如肌肤的颜色就直接受其影响。因此，酪氨酸酶抑制剂是很多美白类化妆品的主要活性物质，能够抑制酪氨酸酶的活性、减少黑色素的形成从而达到美白的目的[1]。

中药材蒺藜为蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，除去杂质[2]。蒺藜中含有主要成分为甾体皂苷、黄酮、生物碱、氨基酸及多糖类[3]。近年来，国内外学者对蒺藜进行了大量研究，结果表明其具有抗动脉粥样硬化、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗衰老与抑制黑色素形成等药理作用[4-5]。近年来，随着国内外学者对中药蒺藜研究的不断深入，李艳莉等研究显示50%的乙醇蒺藜溶液对酪氨酸酶活性的抑制率为54.46%，这说明蒺藜在化妆品应用方面存在潜在价值[6]。

为进一步确认中药蒺藜对酪氨酸酶的抑制作用，同时对比蒺藜呋甾总皂苷和螺甾总皂苷的活性强弱，本文对蒺藜呋甾总皂苷和蒺藜螺甾总皂苷的抑制酪氨酸酶活性进行了对比研究，旨在为中药蒺藜作为美白成分的开发和利用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

表1 实验仪器

表2 实验试剂

2.2 样品制备

取蒺藜干燥果实15.0 kg，粉碎，过20 目筛，用10 倍水煎煮3 次，煎煮时间依次为2.0 h、1.5 h、1.0 h，将提取液过滤后合并，得到蒺藜提取液。提取液过10 kg AB-8 大孔吸附树脂吸附，利用39%的乙醇-水溶液洗脱将呋甾总皂苷洗脱完全，回收溶剂，80℃干燥，得到蒺藜呋甾总皂苷110.0 g。以85%的乙醇-水溶液洗脱将螺甾总皂苷洗脱完全，回收溶剂，80℃干燥，得到蒺藜螺甾总皂苷130.0 g[5]。

2.2.1 0.1 mol·mL-1的HCl 溶液的配制

取0.86 mL 的36%～38%浓盐酸溶液溶于99.14 mL 的水中，即制得0.1 mol·mL-1的HCl 溶液。

2.2.2 pH=6.8 的磷酸盐缓冲溶液配制

取3.582 g 的十二水磷酸氢二钠用去离子水溶解并定容在100 mL 容量瓶中，得到1#溶液；取1.56 g 的二水磷酸二氢钠用去离子水溶解并定容在100 mL 容量瓶中，得到2#溶液；取46.3 mL1#溶液和53.7 mL2#溶液，配制成pH=6.8 的磷酸缓冲溶液100 mL。

2.2.3 L-酪氨酸溶液的配制

用上述0.1 mol·mL-1的HCl 溶液35 mL 溶解0.05 g 的L-酪氨酸，并用pH=6.8 的磷酸盐缓冲溶液在容量瓶中定容至100 mL，即制得L-酪氨酸溶液。

2.2.4 蒺藜呋甾总皂苷溶液的配制

精密称取蒺藜呋甾总皂苷40.0 mg，用去离子水溶解并定容于10 mL 容量瓶，得到浓度为4.0 mg·mL-1的蒺藜呋甾型总皂苷母液，并逐渐稀释至3.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，1.0 mg·mL-1，0.5 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.05 mg·mL-1，0.025 mg·mL-1[5]。

2.2.5 蒺藜螺甾总皂苷溶液的配制

精密称取蒺藜螺甾总皂苷40.0 mg，用去离子水溶解并定容于10 mL 容量瓶，得到浓度为4.0 mg·mL-1的蒺藜螺甾型总皂苷母液，并逐渐稀释至3.5 mg·mL-1，3.0 mg·mL-1，2.5 mg·mL-1，2.0 mg·mL-1，1.0 mg·mL-1，0.5 mg·mL-1，0.1 mg·mL-1，0.05 mg·mL-1，0.025 mg·mL-1[5]。

2.3 实验原理

黑色素细胞合成反应的限速酶是酪氨酸酶，L-酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下会生成多巴，再转化生成在475 nm 处有最大吸收波长的红褐色多巴醌。由于加入样品后，酪氨酸酶的活性受到抑制，因此通过对比加入样品前后在475 nm处测定的吸光度，可以评价样品对酪氨酸酶抑制作用的强弱[1]。

2.4 实验方法

在玻璃试管中分别加入pH=6.8 的磷酸缓冲溶液和L-酪氨酸溶液各5.0 mL，再加入不同浓度的样品水溶液，加入酪氨酸酶后置于37℃恒温水浴锅中反应30 min 后取出；以加入等量的水作为空白对照，在475 nm 处用紫外-可见分光光度计测量吸光度。根据公式（1）计算样品对酪氨酸酶的抑制率。

式中：IR（%）—样品对酪氨酸酶的抑制率，B1—空白对照组的吸光度，T1—样品的吸光度，T0—样品自身的吸光度。

2.5 实验结果与讨论

不同浓度的蒺藜呋甾总皂苷和蒺藜螺甾总皂苷对酪氨酸酶的抑制率如图1 所示。

由图1 可知，当蒺藜呋甾总皂苷浓度为0.5 mg·mL-1时，对酪氨酸酶的抑制率为43.68%，浓度为4.0 mg·mL-1时抑制率为75.62%，说明蒺藜呋甾总皂苷对酪氨酸酶具有一定的抑制能力。当蒺藜螺甾总皂苷浓度为0.5 mg·mL-1时。对酪氨酸酶的抑制率为50.66%，浓度为4.0 mg·mL-1时抑制率为84.1%，说明蒺藜螺甾总皂苷对酪氨酸酶具有一定的抑制能力。

由此可见，在相同浓度下，蒺藜螺甾总皂苷抑制酪氨酸酶的效果明显优于蒺藜呋甾总皂苷，而且随着蒺藜螺甾总皂苷和呋甾总皂苷浓度的增大，对酪氨酸酶抑制能力的差异也逐渐增大。

上述实验结果表明，蒺藜螺甾总皂苷抑制酪氨酸酶能力优于蒺藜呋甾总皂苷。

3 结论

通过抑制酪氨酸酶活性实验对蒺藜呋甾总皂苷和螺甾总皂苷的抑制酪氨酸酶能力进行了对比研究。实验结果显示，蒺藜螺甾总皂苷和呋甾总皂苷都具有抑制酪氨酸酶的能力，并且在0～4.0 mg·mL-1浓度范围内遵循剂量- 效应关系，即随着浓度增大，抑制率也逐渐增加；尤其是在相同浓度下。蒺藜螺甾总皂苷的抑制酪氨酸酶能力优于蒺藜呋甾总皂苷。