食用菌液体菌种防霉剂辅助精简生产技术初探

方向东

（湖南省桂东县农业产业发展服务中心，湖南 桂东 423500）

菌种培育作为食用菌生产的基础在食用菌产业中尤为重要。相对于固体菌种，液体菌种是指通过液体培养基经无菌培养得到的菌丝体或菌种。而液体菌种具有纯度高、活力强，接种后萌发点多，发菌快，缩短菌种发菌时间，成本低，可增加栽培批次，为食用菌集约化、标准化生产创造了条件等优点，随着食用菌产业的发展及技术的提升越来越突出，因此液体菌种被越来越多的生产企业所接受。但同时液体菌种技术推广存在培养基配制设备、摇瓶菌种设备、液体菌种培养设备及接种设备等设备投入大对小规模生产农户存在一定的困难；人员素质要求相对较高；技术标准高及品质鉴定难等不足。为克服和解决食用菌液体菌种生产技术上诸多制约因素与困难，降低液体菌种生产技术门坎，便于液体菌种在食用菌生产上广泛推广与应用，笔者在对本地野生牛肝菌（桂东黄菌、内缘牛肝菌）驯化栽培试验中，开展了大量液体菌种培养试验。然而，在牛肝菌驯化栽培液体菌种制备与生产中，常因设备简陋灭菌消毒不彻底造成杂菌感染而失败，为破解因设备不足、灭菌消毒操作达不到要求等问题，受张宗舟、张扬等人的启发，及借鉴贵州宏宝食用菌科技开发有限公司开发的“食用菌简易液体菌种制作新模式”（液体菌种简易制作新技术_腾讯视频 https://v.qq.com/x/page/t3227wjx1tm.html），设想是否可以通过在液体菌种培养液中添加防霉剂，探寻出一种新型的精简食用菌液体菌种生产技术。经过多批次试验，在食用菌液体菌种培养液中添加山梨酸、苯甲酸钠、丙酸钙、富马酸、富马酸二甲酯等防霉剂多配方方案进行液体菌种培养试验后，得出了在食用菌液体菌种培养液中添加0.02%富马酸二甲酯进行液体菌种培养时，内缘牛肝菌菌种发育良好、杂菌率低的结果。此试验的成功，可以在食用菌液体菌种生产中达到发挥液体菌种优势、弥补液体菌种缺点的效果，该技术既降低了液体菌种生产设备、生产技术、资金投入等准入门坎，简化了生产流程，降低了生产成本，又可以实现满足批量或小型种植户自繁自用的需求，在食用菌科研与生产中颇具现实意义，现将有关技术操作与要点作简要介绍，供广大食用菌科研生产工作者参考。

1.材料与方法

1.1 采用的设备及工具。采用的设备主要来源于家庭日常用具，包括：不锈钢锅、电磁炉或燃气灶、压力锅、天平、秤、量杯、油桶等窄口液体容器、鱼缸增氧气泵、漏斗、长40cm左右木棒、接种刀等常用接种工具、酒精灯、220V定时插座等。

1.2 备用材料。2mm厚度土工布、纸巾、纱布、6mm胶管及调节阀、高锰酸钾、碘伏、新鲜内缘牛肝菌子实体等。

1.3 培养液基础材料及配方。水86.6%，马铃薯8%，红糖1.2%，葡萄糖0.8%，麦麸2.4%，蛋白胨0.12%，磷酸二氢钾0.12%，硫酸镁0.06%，维生素B10.08%，白醋0.4%，消泡剂0.2%。

1.4 添加防霉剂试验方法。将山梨酸、苯甲酸钠、丙酸钙、富马酸、富马酸二甲酯等防霉剂按不同剂量添加到上述培养液中，进行液体菌种培养，使用同样的处理方式设置三次重复进行试验，在室温24-28℃下培养15天后对培养液进行过滤，采用量杯对过滤出来的液体菌种菌丝数量进行统计分析，不同防霉剂及不同剂量见表1。

表1 不同防霉剂剂量（占培养液百分比）

1.5 试验操作工艺流程。清洁用具→配制培养液→培养液高温高压灭菌→培养液冷却→灌装混合液到油桶→接种箱及接种工具灭菌消毒→新鲜食用菌子实体制作接种菇块。（可以采用食用菌母种或原种代替，如采用母种或原种接种可以跳过本操作）→接种→静置培养→增氧泵增氧带搅动培养。

1.6 操作工艺流程解析

1.6.1 清洁用具。清洁用具时可用自来水、泉水等相对清洁的水清洗，对有污垢的用具要用清洗刷或清洁球进行擦拭，直至无污垢后即可，对有油污的用具要用清洁剂进行清洗，直至无油污即可，清洗后用0.05%高锰酸钾溶液等消毒液擦拭一遍或浸泡30分钟-40分钟，然后倒掉消毒液备用。

1.6.2 配制培养液。先按培养液配方用天平或秤称取所需物质备用，在配制培养液时先将马铃薯切成薄片，倒入事先准备好的不锈钢锅中，随后把麦麸倒入锅中，按比例加足水，在电磁炉或燃气灶上煮沸后持续煮30分钟，用2层医用纱布捆扎在高压锅口上，把煮沸过的土豆、麦麸混合物往高压锅里倒，过滤掉土豆、麦麸渣形成棕色清液，然后往高压锅内加入其它配料并用棍棒搅拌3分钟至配料溶化。

1.6.3 培养液高温高压灭菌。培养液在高压锅内加热至高压锅额定压力后保持压力60分钟实现培养液高温高压灭菌。

1.6.4 培养液冷却。让高压锅内培养液在室温下自然冷却至25-30℃备用。

1.6.5 灌装混合液。将上述培养液用胶管采取虹吸方式灌装到油桶中，灌装到油桶容量的60%即可，每灌好一桶即取一段长40cm左右的增氧泵胶管用纸巾卷起制作成油桶瓶塞，塞住油桶口，伸入油桶内的胶管底端要捆扎一个略重的坠子，确保能插到油桶底部而且在增氧充气时不上浮，纸巾做成的塞子要松紧适度，以肉眼看不到孔洞又能塞在瓶口不往下掉即可，混合液体在灌装过程中应尽量只揭开高压锅盖一条小缝，避免不必要的混杂空气进入桶内。注意在材料煮和压力锅消毒时损失的水分在灌装时用30℃左右的温开水进行补充。

1.6.6 接种箱及接种工具灭菌消毒。接种工具全部移入接种箱，接种箱及接种工具按常规方法进行灭菌消毒，可以采取臭氧法灭菌30分钟，也可以采取紫外线照射灭菌40分钟。

1.6.7 新鲜食用菌子实体制作接种菇块（如采用母种或原种接种可以跳过此操作过程）。选取新鲜无虫害无腐烂未全开的健壮食用菌作种菇，首先，将新鲜食用菌子实体切除带泥菇脚和有虫驻孔部分，移入已消毒的接种箱内后用碘伏浸泡20分钟，或用棉签沾碘伏通体擦拭一遍后静置20分钟进行灭菌消毒。然后将已灭菌消毒处理过的食用菌子实体用接种刀切成5mm左右大小的块状菇块。

1.6.8 接种。按照常用接种方法进行接种，将装有培养液的油桶置于接种箱内，揭开瓶塞倒入切好的菇块10小块或5mm左右大小的母种（或原种）8小片倒入桶中，塞回瓶塞即可移出接种箱完成接种。

1.6.9 静置培养。将接种好的装有培养液的油桶放置在温度24-30℃的室内静置培养24-48小时，观察接种的菌种长出绒毛状菌丝后即已完成静置培养阶段。

1.6.10 增氧泵增氧及气流搅动培养。静置培养后观察油桶内菌种已萌发新菌丝出来后，即可接入增氧泵通气增氧了，增氧充入空气过程中形成对流可对培养液形成搅动作用，把增氧泵放入60cm见方的水果框中，用2mm厚的无纺布包裹围实水果框，对吸入的空气进行过滤，此流程应提前1天打开增氧泵对水果框内空间进行预净化，增氧泵插头连接在定时插座上，定时插座设置开20分钟停30分钟循环状态，培养环境温度在24-30℃为宜，最适宜温度27℃，若环境温度低于24℃或高于30℃应采取一些增温或降温措施，增氧搅动培养一般在15天左右即可完成。

2.结果与分析

2.1 不同剂量防霉剂对杂菌和食用菌菌丝生长影响结果

不同防霉剂不同剂量在液体菌种培养中，表现出对抑制杂菌、食用菌菌丝生长表现各异，其作用主要通过培养出的食用菌菌丝数量多少来鉴定，培养15天后的三次重复的测定结果见表2、表3、表4。

表2 一次重复不同防霉剂剂量培养的食用菌菌种数量

表3 二次重复不同防霉剂剂量培养的食用菌菌种数量

表4 三次重复不同防霉剂剂量培养的食用菌菌种数量

2.2 分析

2.2.1 从表2、表3、表4的数据可以很直观地看出，添加富马酸二甲酯的处理与其它处理表现出极其明显的差异性，添加防霉剂富马酸二甲酯的处理随着添加剂量的增加抑制杂菌能力增强，在添加剂量为占培养液的0.02%时表现非常突出，富马酸二甲酯有效抑制了杂菌生长，净化与维护了食用菌菌丝生长环境，食用菌菌丝得以实现正常生长，随着剂量继续增加时对食用菌菌丝生长影响也明显增强。

2.2.2 在未严格进行灭菌消毒的培养液中进行食用菌菌丝培养时，食用菌菌丝与杂菌是共存的，食用菌菌丝与杂菌是一种竞争关系，相互之间是此消彼长的关系，从三次重复试验结果可以明显看出，不同防霉剂对杂菌和食用菌都有一定的抑制作用，在添加低剂量防霉剂或不添加防霉剂的对照处理中，杂菌繁殖能力与增殖速度快，而食用菌菌丝生长能力与增殖速度远不及杂菌，在杂菌没有得到有效抑制的情况下食用菌菌丝难以生长甚至接种萌发不成功。

2.2.3 在添加高剂量防霉剂的培养液中，食用菌菌丝将完全被抑制生长。

3.讨论

3.1 食用菌液体菌种培养中在某些药剂适当剂量的辅助作用下，是可以实现较粗放灭菌情况下食用菌菌丝正常生长的。在内缘牛肝菌液体菌种培养中，添加占培养液0.02%比例的富马酸二甲酯，由于富马酸二甲酯的抑菌作用，杂菌得到有效抑制，内缘牛肝菌液体菌种菌丝生长良好，杂菌率很低对大田生产影响甚微，可以在该食用菌试验与生产中加以应用。

3.2 本试验不同之处，一是在食用菌液体菌种生产中利用富马酸二甲酯独特的抑菌效果，在食用菌液体菌种培养液中添加适当剂量的富马酸二甲酯抑制杂菌生长的同时为食用菌生长提供了有利的生长环境；二是简化了液体菌种生产流程，如在食用菌液体菌种生产中可以直接使用食用菌子实体进行接种，使用的用具和材料及所处环境无需进行严格灭菌消毒等方面；三是在食用菌液体菌种生产中可以充分利用家庭常用设备和用具，无需购置摇床、培养罐等专用食用菌液体菌种生产设备，大大降低了食用菌生产设备、技术与投入门坎和生产成本，生产规模也可以依据生产者需求自主可控，有利于有适宜条件有发展食用菌产业意愿的广泛农户参与到食用菌产业中来，为提高农民收入多了一些可选择的产业发展路子。

3.3 不同的食用菌对药剂的选择及剂量要求有待进一步试验，除了在食用菌液体菌种试验与生产上之外，在固态食用菌菌种生产及大田生产中也有一定借鉴意义。