间充质干细胞来源外泌体促进皮肤损伤创面修复的作用及机制研究进展

丛海燕 王 娜 常 鑫 王海涛 杨金存

1.山东大学附属威海市立医院中心实验室，山东 威海 264200；2.大连医科大学检验医学院，辽宁 大连 116044；3.山东大学附属威海市立医院烧伤整形科，山东 威海 264200；

皮肤是人体最大的器官，其主要功能是保护人体免受病原体的侵袭。糖尿病或大面积烧伤等因素经常会损伤皮肤，不仅给患者带来身体和精神上的痛苦，还会造成巨大的社会经济负担，因此，许多研究都在关注如何加速伤口愈合［1-2］。间充质干细胞具有强大的增殖分化能力，目前已被广泛应用于创伤修复和组织再生等研究中，且被证实具有良好的皮肤损伤修复功能。

虽然干细胞的更新修复能力较强，但在临床应用中仍存在较多缺陷，包括：免疫原性过强，会引起机体排斥等不良反应［3］，引起治疗效率低下［5］；分裂增殖能力强，有致瘤风险［4］；移植过程中涉及伦理问题。研究表明，干细胞移植后，只有少数干细胞通过分化来替代受损组织，其发挥作用的主要机制是依赖旁分泌改变局部微环境［6-7］。外泌体是干细胞旁分泌的重要组分，与干细胞相比具有免疫原性低、稳定性高、活性高、不易致瘤等优势［8］，近年来引起广泛关注，被应用到多种形式皮肤损伤的治疗研究中。本文就各类间充质干细胞外泌体在多种形式皮肤损伤中的治疗应用及其作用机制的研究新进展进行综述。

1 外泌体的生物学特性

外泌体是细胞通过特殊的内吞外排机制主动向胞外分泌的一种直径为30 ～100 nm的微型囊泡，几乎所有的活细胞都可以分泌外泌体［9-11］。此外，外泌体还存在于唾液、血浆、尿液等多种类型的体液中［12-14］。外泌体主要由脂质、蛋白质和核酸构成，脂质构成了外泌体的膜结构，为外泌体提供了结构稳定性并包裹着蛋白和核酸（miRNAs、mRNA、lncRNA等）等活性物质。

正常细胞来源的外泌体能够有效清除细胞代谢废物并介导细胞间信息转导，但某些特殊细胞分泌的外泌体，由于携带分泌细胞的特异性活性物质，因此具有特殊的生物学功能，如肿瘤细胞来源的外泌体因携带特殊的miRNA，具有免疫学标志功能，可作为诊断标志物［15-16］。干细胞来源的外泌体含有干细胞分泌的多种蛋白和核酸，因此具有促进细胞分裂增殖、调节机体免疫反应等作用。

2 皮肤愈合的过程和机制

皮肤是附属在体表外最大的器官，一些理化因素会造成皮肤的损伤，常见的有创伤、烫伤和烧伤，还有慢性疾病引发的皮肤损伤，如糖尿病引发的溃疡。皮肤损伤的修复可以概括为以下4 个时期：①血液凝固期：损伤初期血小板和凝血因子被激活，启动内、外源性凝血途径实现凝血；②炎症反应期：中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞增多，通过吞噬异物和调节炎症因子的释放调控炎症反应；③细胞增殖期：包括通过成纤维细胞增殖介导肉芽组织形成、通过角质细胞介导再上皮化和通过内皮细胞增殖介导血管生成等过程；④组织重塑期：随着细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的分泌和肉芽组织的增生，成纤维细胞分裂合成大量胶原纤维，新生血管增多。后期在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作用下，降解ECM，胶原蛋白发生新陈代谢，最终导致瘢痕的形成［17］。

3 间充质干细胞外泌体促进皮肤损伤修复的机制

皮肤愈合是一个复杂的过程，需要免疫细胞、上皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞以及各种生长因子协同发挥作用。外泌体携带间充质干细胞的多种活性物质，通过向靶细胞转运活性蛋白和核酸等分子，在炎症反应期、细胞增殖期和组织重塑期发挥作用，参与调控创面愈合过程中的炎症反应、细胞增殖和迁移、血管生成与基质重建等多个方面，促进创面愈合并抑制瘢痕形成［18-19］。

3.1 外泌体在炎症反应期的作用及机制

炎症反应是调控创面修复的重要阶段，多种炎症细胞和各种炎症因子协同参与炎症反应对抗感染。巨噬细胞是重要的炎症细胞，具有促炎M1 和抗炎M2 两个表型。研究显示，间充质干细胞外泌体可以促进巨噬细胞M2 极化，对抗皮肤损伤引起的炎症反应，此过程中伴随着各种炎症因子表达量的变化。人骨髓间充质干细胞外泌体（human bone marrow mesenchymal stem cell exosome, hBMSCEXO）可以通过激活PTEN/AKT 信号通路来促进巨噬细胞抗炎表型M2型极化，抑制促炎表型M1型极化，并且抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达，促进抗炎因子IL-10 的表达，加快了糖尿病小鼠皮肤损伤的愈合［20］。在模拟炎症状态下，人脐带血间充质干 细 胞 外 泌 体（human umbilical cord bloodmesenchymal stem cell exosome, hucMSC-EXO）中特异表达的miRNA let-7b 通过TLR4/NF-κB/STAT3/AKT 信号通路稳定调节巨噬细胞的极化，促使巨噬细胞向抗炎表型M2 型分化，减轻了炎症反应并促进了糖尿病皮肤伤口的愈合［21］。hucMSCEXO的miRNA微阵列分析显示，与成纤维细胞外泌体相比，hucMSC-EXO 中miR-21、miR-146a 和miR-181上调表达较显著，通过文献回顾，认为上述3种miRNA在伤口炎症反应中具有炎症调节的功能［22］，其中miR-181 的抗炎作用已被证实。hucMSC-EXO中的miR-181可以降低烧伤部位中性粒细胞和巨噬细胞的数量，抑制TLR4信号通路，抑制调控炎症反应重要因子NF-κB/P65 和p-P65 蛋白的激活，阻止炎症因子IL-1β 和TNF-α 的释放，促进抗炎因子IL-10的表达，发挥抗炎作用［23］。

3.2 外泌体在促进细胞增殖期和抑制细胞凋亡中的作用机制

细胞增殖和皮肤再上皮化是创面愈合的关键，此阶段依赖成纤维细胞和上皮细胞不断增殖迁移。成纤维细胞增殖产生ECM，包括纤连蛋白和Ⅰ型、Ⅲ型胶原。上皮细胞增殖并向创面中心迁移，介导再上皮化，减少皮肤感染。

干细胞外泌体已被证实可以通过内化途径直接进入成纤维细胞促进其增殖迁移和胶原合成，进而促进伤口愈合［24］。脂肪间充质干细胞外泌体（adipose-derived mesenchymal stem cell exosome,ADSC-EXO）进入成纤维细胞后，通过上调N-钙黏素（N-cadherin）、细胞周期蛋白-1、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、金属蛋白酶1（metalloproteinase 1，MMP1）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和转化生长因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）的表达刺激细胞增殖和胶原合成，加速皮肤创面愈合［25-26］。

外泌体还可以通过释放活性物质至受体细胞内，实现对受体细胞增殖迁移的调控。hucMSCEXO中的Wnt4蛋白能激活wnt/β-catenin信号通路、Jagged1 蛋白能激活North 通路，促进角质细胞和成纤维细胞的增殖和迁移及合成ECM的能力，促进创面愈合［27-28］。胎儿真皮间充质干细胞外泌体（fetal dermal mesenchymal stem cell exosome, FDMSCEXO）的Jagged 1蛋白也可激活North通路发挥同样的功效［29］。脂肪干细胞外泌体（adipose-derived stem cell exosome,AD-EXO）中的miR-21 可以激活PI3K-AKT 通路、lncRNA MALAT1 锚 定miR-124 可以激活wnt/β-catenin 信号通路，促进皮肤损伤模型中的角质细胞和成纤维细胞的增殖、迁移，并抑制细胞凋亡［30-31］。hBMSC-EXO 中的lncRNA H19 在成纤维细胞中与miR-152-3p结合，抑制磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表达，同时激活PI3K/AKT 信号通路，促进成纤维细胞的增殖、迁移并抑制其凋亡，促进糖尿病小鼠伤口的愈合［32］。

3.3 促进血管再生

皮肤愈合的血管生成阶段主要依赖内皮细胞的增殖以及各类血管生成因子的相互作用。外泌体可直接作用于内皮细胞，或通过调节血管生成相关的生长因子、细胞因子、趋化因子等的表达水平间接作用于内皮细胞，促进血管形成，为新生组织提供营养和氧气。

人胎盘来源间充质干细胞（human placenta derived mesenchymal stem cells,PMSCs）分泌相当数量的促血管生成分子，可显著改善糖尿病大鼠皮肤创面的血管生成。在此过程中，旁分泌机制发挥了重要作用，而该作用很可能是通过外泌体介导实现的［33］。Liu 等［34］发现hucMSC-EXO 通过血管生成素2（Ang-2）促进了血管内皮细胞的迁移和成管能力，促进创面的血管生成。hBMSC-EXO 的蛋白组学分析结果显示，外泌体中有1 927种蛋白质，其中多种与血管生成相关，如血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子以及NFk-B 信号通路蛋白等，可直接促进血管生成［35］。除了直接作用于血管内皮细胞外，外泌体中携带的活性蛋白或核酸等，可以调节内皮细胞内的其他活性因子的表达，间接促进血管生成。如hucMSC-EXO 中的Wnt4 蛋白可以进入内皮细胞，诱导内皮细胞β-catenin 活化，增加PCNA、cyclin-D3和N-cadherin的表达，促进血管生成［27］。ADSC-EXO 富含miR-125a，可以抑制血管生成抑制因子DLL4 的转录和表达，通过促进内皮尖端细胞的形成来促进内皮细胞生成血管［36］。hucMSC-EXO 中miR-21-3p 高度富集，可以下调PTEN 和SPRY1 的表达进而调节PI3K/Akt 和ERK1/2 信号通路，实现内皮细胞的促血管生成作用，但miR-21-3p 并不是hucMSC-EXO 发挥促血管生成作用的唯一介质，其他信号分子可能也参与了这一过程［37］。

3.4 抑制瘢痕形成

瘢痕形成是伤口愈合的最后一个过程，瘢痕形成的主要机制是成纤维细胞显著增生，胶原蛋白过度沉积，并合成细胞外基质，导致病理性瘢痕形成。

ADSC-EXO注射后，小鼠创面组织学分析显示，在伤口愈合的早期，外泌体增加了Ⅰ和Ⅲ型胶原的生成，而在后期，外泌体可能抑制胶原表达，以减少疤痕形成［25］。

Fang 等［38］在hucMSC-EXO 中发现一组特异性miRNA（miR-21、miR-125b 和miR-145）通 过 抑 制TGF-β/SMAD途径，抑制TGF-β与相应受体结合，切断细胞间的信号转导，抑制肌成纤维细胞激活，减少肌动蛋白生成和胶原沉积，从而抑制瘢痕形成。hucMSC-EXO 还 可 以 递 送14-3-3ζ 促 进p-LATS 和YAP结合，增强YAP磷酸化进而抑制Wnt/β-catenin通路的激活，从而限制真皮成纤维细胞的过度扩张和胶原沉积，抑制瘢痕的形成［39］。ADSC-EXO 通过调节III型和I型胶原比例调节胶原蛋白的沉积和排列，通过调节TGF-β3和TGF-β1比例调节成纤维细胞分化，减轻瘢痕形成。还可激活ERK/MAPK通路增加皮肤真皮成纤维细胞MMP3 的表达，导致MMP3 与基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）的比例增高，这也有利于ECM 的重塑，促进无瘢痕创面修复［40］。

4 外泌体调控在创面愈合中的应用

间充质干细胞外泌体已被证实对皮肤创面愈合有显著的促进作用。研究发现，近年来利用分子生物学手段或细胞工程技术对外泌体或干细胞进行预处理，会进一步提高外泌体的效能。

根据外泌体的生物相容性，通过电穿孔将miR-21-5p 模拟物加载到人脂肪干细胞外泌体（hASCEXO）中，调控后的外泌体通过Wnt/β-catenin 信号通路促进再上皮化、胶原重塑、血管生成和成熟，加速糖尿病创面愈合［41］。从过表达miR-126的骨髓间充质干细胞中分离出的外泌体（Exo-miR-126），通过靶向PIK3R2 激活PI3K/Akt 信号通路，可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管生成。在体内给药Exo-miR-126 显著增加了毛细血管数量，加速创面愈合［42］。同样，过表达lncRNA H19 和Nrf 2 的间充质干细胞所分泌的外泌体都增强了糖尿病足的愈合效果［32，43］。以上研究表明，外泌体与特定功能的分子相结合是促进创面愈合新的手段和策略。

除直接搭载功能分子外，在干细胞培养阶段，施加某些生物、化学、物理因素也可以影响并增强外泌体的创面修复能力。研究表明，经新生儿血清培养的间充质干细胞所分泌的BMSC-EXO 促进创面愈合的效果更佳［44］。经阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）预处理的ATV-BMSC-EXO，能促进血管的形成，可以更显著地提高糖尿病大鼠伤口再生的能力［45］。由Fe3O4纳米颗粒和静磁场（static magnetic fields，SMF）预处理的骨髓间充质干细胞所分泌的外泌体（mag-BMSC-EXO）中，miR-21-5p 高度富集，可通过抑制SPRY2，激活PI3K/AKT 和ERK1/2 信号通路，加速大鼠皮肤创面愈合，且愈合后的疤痕宽度更窄，血管生成增强［46］。

5 外泌体在创面治疗中给药方式的研究进展

目前，外泌体治疗皮肤损伤常用的给药方式为体内注射和局部注射，但注射不能使外泌体与损伤部位直接接触，还会因为体内的清除效应，影响其功能的发挥［47］，因此，近年来研究者不断尝试新的生物支架，作为外泌体的缓释载体，维持其在创面的生物活性，进一步加速创面愈合。其中，应用较多的载体为水凝胶。生物医学水凝胶的结构类似于天然的ECM，不仅具有良好的生物相容性，还能改变细胞生长的微环境。Wang 等［48］制成多功能FHE 水凝胶，ADSC-EXO 通过静电作用加载到FHE水凝胶中。与单纯的外泌体相比，该水凝胶可通过持续释放外泌体，获得更佳的促进创面愈合效果。Shi 等［49］利用壳聚糖和丝素制备成水凝胶海绵，并在此基础上添加了外泌体，添加了外泌体的水凝胶可通过促进胶原蛋白的再上皮化、促进血管生成和神经元长入，有效促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合。另外，还有研究指出，外泌体与PF-127水凝胶［50］、海藻酸盐水凝胶［51］、壳聚糖水凝胶［52］、负载了姜黄莪术多糖的壳聚糖/丝水凝胶［53］、天然甲基纤维素-壳聚糖水凝胶［54］等形式的水凝胶相结合，具有良好的机械性能、保水性、抗感染能力和细胞生物相容性，会更稳定高效地发挥外泌体对创面的愈合效果。

6 小 结

本文综述了间充质干细胞外泌体的生物学特性及其在皮肤损伤修复方面的作用机制，综上，外泌体对创面愈合的促进作用已得到充分的证实。间充质干细胞外泌体与干细胞相比具有高稳定性、高效性等优势，最重要的是外泌体具有可调控性，可以通过多种调控手段调控其内部活性物质的种类和含量，以增强其创面愈合的效果。外泌体与生物载体的结合，能使其更高效稳定地发挥疗效。

虽然现有研究展示了外泌体的广阔应用前景，但目前仍存在诸多问题阻碍其临床应用：一方面是外泌体的内容物和功能受分泌细胞种类和状态的影响，涉及的信号通路错综复杂，尚未完全透彻阐明；另一方面是外泌体的提取鉴定操作复杂且没有统一标准，不能规模化和标准化生产。因此，目前外泌体对创面愈合的研究只停留在实验室探索阶段。今后，需要更多的研究来进一步阐明间充质干细胞外泌体促进创面愈合的机制，并进一步革新其制备与纯化技术，探究其在临床治疗中发挥的功效，进一步推动其在再生修复领域发挥作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突