缺氧诱导因子-1α/Notch1通路在缺氧致病机制中的研究进展)

林千愉 张 慧 梁 栋 张晓敏

氧是细胞代谢和生物产能的必需物质，当需氧量大于供氧量时，细胞需要迅速调整新陈代谢才能使组织存活。生物体对氧的感知影响一系列过程，包括生长发育、新陈代谢、pH动态平衡和血管生成等。缺氧是多种疾病的发病机制之一，如癌症、心血管疾病和卒中等。处于缺氧状态时，机体会启动以缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)为主介导的应激反应。Notch信号作为传递缺氧反应的关键中间体，其与缺氧应激在多个生理与病理过程中存在串扰。以下对HIF-1α/Notch1通路在缺氧致病机制中的作用的相关研究进展进行综述。

1 HIF-1α/Notch1通路概述

HIF是由不稳定α亚基和稳定β亚基组成的异二聚体。哺乳动物有3种HIFα亚型，其中HIF-1α在所有细胞中广泛表达，而HIF-2α和HIF-3α在某些组织中选择性表达。HIF-1α与HIF-2α的结构相似，而HIF-3α以多重剪接变体的形式存在，部分参与抑制HIF-1α和HIF-2α的活性。当持续性缺氧时，HIF-1α高表达并与HIF-β二聚化，通过其启动子中的低氧反应元件(hypoxic response element，HRE)激活下游基因表达参与典型缺氧反应来对抗缺氧，如激活葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1) 的表达增加葡萄糖摄取，激活促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的表达促进红细胞生成，激活血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达促进血管生成等。缺氧诱导因子1抑制因子(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1，FIH1)是调控HIF-1α的关键酶之一，该因子是一种天冬酰胺羟化酶，能够感受细胞内氧张力的变化，可通过使HIF-1α基因Asn803位点羟基化抑制HIF的反式激活活性。

Notch信号是一种进化保守的细胞-细胞通讯机制，在多种细胞类型和不同发育阶段起作用，是决定细胞命运的重要通路之一。Notch信号的激活需要Notch受体(Notch1～Notch4)和Notch配体(Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3、Dll4)相互作用。在哺乳动物中，4种不同的Notch跨膜受体都可被膜系配体激活，其中Notch1作为最容易被监测的Notch家族的受体，具有细胞表面受体和转录调控的双重功能，在肿瘤转移及调控细胞命运方面有重要作用。解整合素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM )特别是ADAM10和某些情况下的ADAM17可介导 Notch1 的 S2 位点切割，之后由γ-分泌酶在其 S3 位点切割，释放出Notch胞内段(Notch intracellular domain，NICD)，而NICD又转移到细胞核并调节特定环境下的基因表达模式。同时，Notch信号的核心途径的各个步骤均可调控，从而导致信号多样性。

Påhlman和Poellinger的研究小组最早发现Notch靶基因在缺氧诱导转录组分析中被上调，提示Notch信号可能以某种方式与细胞的缺氧反应相关[1]。HIF-1α可作为Notch信号的上游因子，通过与NICD相互作用及促进配体表达等多个途径激活Notch信号，提示了缺氧微环境中HIF-1α/Notch1通路的存在。

2 HIF-1α/Notch1通路的调控机制

Notch信号与缺氧之间的联系代表了缺氧反应的一个新方向。在典型的缺氧反应中，缺氧通过改变HIF-1α的稳定性和活性，导致HIF-1α与特定靶基因中含有HRE的调控元件结合，激活某些基因转录。作为传递缺氧反应的关键中间体，Notch信号在典型的缺氧反应介入后导致其信号的激活和下游基因的转录。在低氧条件下，HIF-1α与信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)协同上调Vasorin蛋白的表达，Vasorin结合Notch1，调节其在细胞膜上的表达，从而校准Notch通路的激活[2]；HIF-1α促进NICD的转录，诱导NICD及其下游基因发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split 1，HES1)的表达[3]。此外，HIF-1α也可促进Notch1配体Jagged1[4]和Jagged2[5]的表达，通过与Notch1受体结合导致Notch信号的激活。缺氧还可以通过增加γ-分泌酶的活性和释放更多的NICD来促进Notch1的活性[6]。HIF-1α作为Notch1-HES1负反馈环的阻滞剂，通过抑制HES1基因的转录激活，增强Notch信号的表达[7]。

但也有研究[8]发现，缺氧在增加特定细胞系中HIF-1α和HIF-2α表达的同时抑制了Notch1的激活，表明HIF的上调并不总是导致Notch信号的激活。缺氧与Notch信号之间的相互作用发生在多个水平上，Notch1抑制剂DAPT可在转录和翻译水平上调控HIF-1α的表达[9]，Notch1 小干扰RNA(siRNA)处理可消除低氧诱导的滑膜内皮细胞中HIF-1α的表达[10]，均提示在HIF-1α/Notch1信号通路中存在反馈环。HIF-1α及其下游靶基因的表达需要信号转导和STAT3的磷酸化，Notch信号通路可促进STAT3磷酸化来激活缺氧途径，通过依赖于HES1的SRC/STAT3通路刺激HIF-1α靶基因的表达[11]。HIF-1α水平的增高通常被认为是泛素化介导的降解受到抑制。最近有研究[12]结果表明其还受微RNA(microRNA，miRNA)控制,如miRNA-34a基因敲除可通过激活HIF-1α/Notch1信号通路减少脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤和神经细胞凋亡。HIF-1α蛋白水平和活性受PI3K/Akt介导的蛋白质合成和MEK/MAPK介导的翻译后修饰的调节[13]，同时NICD的抗凋亡、促增殖和分化作用依赖于PI3K/Akt信号。Notch信号通过PI3K/Akt信号调控HIF-1α蛋白表达。

3 HIF-1α/Notch1通路在缺氧中的作用

3.1 生长发育 在哺乳动物心脏发育中，缺氧和HIF-1α通过调节发育中心脏的结构生成和心肌发育而发挥重要作用。然而，缺氧和HIF-1α在干细胞心脏分化中的作用一直存在争议，缺氧可以通过HIF-1α/Jagged1/Notch1信号通路促进心肌干细胞早期心脏分化[14]，也可以抑制干细胞的心脏分化[15]。Notch信号通路参与了心肌细胞分化和心脏发育的多项调控，但其在干细胞心脏分化中可能发挥阶段特异性的双相作用[16-17]。有研究[18]结果表明，在心肌分化早期，缺氧可促进HIF-1α过表达所诱导的NICD1-HIF-1α复合体的形成，在缺氧诱导的去分化脂肪(dedifferentiated fat, DFAT)细胞向心肌细胞分化中起潜在作用。Notch信号通路可与缺氧相互作用，以保持肌源性细胞系C2C12、卫星细胞和神经干细胞处于未分化状态[19]。

Notch信号在肾单位的形成中起关键作用，在成熟肾脏中不活跃，其在成熟肾脏中的重新激活与糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)的发生和发展密切相关,包括足细胞损伤、肾小管间质纤维化，以及可能的血管生成和免疫系统的激活。本课题组前期的研究[20]证明，高糖环境导致肾组织处于缺氧状态，HIF-1α在足细胞细胞核中高表达。最新的研究[21]结果表明，Notch信号抑制剂DAPT可能通过提高抗氧化活性和增加HIF-1α的表达，从而减少糖尿病肾损伤。HIF-1α与Notch信号的串扰现象为进一步研究DAPT对糖尿病肾功能的保护作用提供了新的思路。虽然现有的研究结果表明，DAPT在糖尿病大鼠肾损伤修复中有很好的应用前景，但因为这种细胞间信号在脊椎动物的发育和生理过程中发挥着多种作用，应警惕Notch抑制的潜在不良反应。

HIF-1α/Notch1通路不仅参与维持细胞活性及功能，同时作用于多种机体的生理过程。Notch-HES1信号通过失活p53和激活NF-κB信号来增强糖酵解，而敲除HIF-1α可显著减弱活化Notch1诱导的糖酵解，表明糖酵解途径受Notch信号和HIF的协同调节[11]。在低氧条件下，人脂肪源性基质细胞(human adipose-derived stromal cell，hASC)为了维持未分化状态，通过Notch信号显著提高糖酵解速率和增殖效率，防止衰老[22]。髓核是椎间盘退变最早发生的部位，HIF-1α通过Notch1途径调节人髓核细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，维持细胞外基质的动态平衡[23]。脊索细胞是成熟椎间盘髓核内所有细胞的胚胎前体，存在于髓核发育的早期，并保留在成年髓核中，其大量丢失被认为是椎间盘退变的发病机制之一，而HIF-1α/Notch1通路的激活对于脊索细胞的维持是必不可少的[24]。

3.2 血管生成 血管生成是指在原有血管的基础上分支形成新的微血管，包括内皮细胞的新生、增殖和迁移，管状血管的形成、分支和吻合等多个步骤的生物学过程。在缺氧条件下，血管生成这一过程起始于促血管生成因子与抗血管生成因子之间的不平衡，主要涉及VEGF/VEGF受体通路、血管生成素(angiopoietin, Ang)/Tie2轴和Notch通路3条信号通路。

血管生成对于脑卒中和其他神经退行性疾病影响区域的神经血管基质重塑至关重要，有助于功能性神经和突触的生成。同时，血管生成可以改善缺血脑组织的灌注，较高的血管密度会适当延长缺血性卒中后患者的存活时间。溶栓治疗是脑梗死的一种有效治疗措施，但由于治疗时间窗短，未能及时治疗的脑梗死患者预后较差。此外，即使溶栓成功，缺血后的持续再灌注通畅也会对脑组织造成继发性损伤，即脑缺血再灌注损伤。HIF-1α作为缺氧或缺血过程中的主要调节因子，通过调节其靶基因血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表达，在缺血性卒中的脑血管生成中发挥重要作用，不仅介导VEGF/Notch1信号通路参与侧支循环的形成，还可上调抗凋亡蛋白bcl-2、下调促凋亡蛋白Bax的表达[25]，显示出神经保护作用[26]。研究[27]发现，锦鸡儿总黄酮通过激活HIF-1α/VEGF/Notch1信号通路促进血管生成，保护脑微血管内皮细胞免受缺氧复氧损伤。

血管生成还能有效改善缺血心肌的血供。促血管生成因子，如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，可以显著促进缺血区侧支血管的增殖，从而缩小梗死面积[28]。HIF-1α可激活多种基因的转录，包括VEGF、VEGF受体flt-1和bFGF[29]。

虽然，血管生成有利于缺血性疾病的治疗，但血管生成同样参与了多种疾病的发病过程。HIF-1α可通过Notch1/STAT3/内皮素B型受体(endothelin receptor type B，ETBR)途径调节滋养层细胞血管生成，参与子痫前期的发生[30]。同时，过度的血管生成容易引起动静脉畸形，进而增加出血的风险，一定程度上会导致糖尿病视网膜病变复杂化，增加糖尿病的冠状动脉及外周并发症发生[31]。HIF-1α和HIF-2α调控Notch1、Ang2和Dll4的表达，促进内皮细胞血管形成，诱导胃肠道畸形血管生成，沙利度胺可逆转这一作用[32]。上述研究结果提示，调节促血管生成和抗血管生成作用的平衡尤为关键。

血管生成已成为肿瘤治疗的重要靶点之一。Notch1是肿瘤血管生成的调节因子，Notch-1过表达促进了骨髓瘤的细胞生长和肿瘤血管生成。茶黄素双没食子酸酯(theaflavin 3,3’-digallate，TF3)在人卵巢癌OVCAR-3细胞中通过抑制Notch1/c-Myc通路部分下调HIF-1α和VEGF，提示Notch 1/c-Myc途径可能在TF3的抗血管生成作用中起辅助作用[33]。HIF-1α在调节滋养层细胞的分化和侵袭，以及螺旋动脉重建中起重要作用，可通过调控Notch1/ETBR信号转导，从而调节滋养层细胞的侵袭和血管生成[30]。HIF-1α/Notch1反馈环路在血管生成中发挥重要作用，因此，针对环路中的关键因子HIF-1α及Notch1的靶向治疗可能为抗肿瘤血管生成提供一种新的治疗策略。

3.3 上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT) EMT和肿瘤干细胞被认为与肿瘤的恶性进展有关。EMT的特征是细胞-细胞连接的溶解，以及顶端-基底极性的丧失，导致形成具有侵袭性的迁移性间充质细胞。微环境氧水平的变化和HIF激活低氧信号通路被认为是EMT的重要触发和调节因子[34]。HIF-1α通过诱导EMT促进肿瘤的侵袭、转移。Notch信号是缺氧与EMT偶联所必需的。HIF-1α的过表达通过调控依赖Notch信号通路的EMT促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Notch信号通路通过改变Snail的表达，调节上皮细胞标志物E-cadherin和系膜细胞标志物N-cadherin的含量，从而导致EMT。癌症干细胞(cancer stem cell, CSC)是具有自我更新和分化能力的一小部分癌细胞，在多种癌症中推动肿瘤的起始、进展和转移。此外， CSC的富集还与化学治疗耐药有关。因此，CSC的靶向治疗具有重要临床意义。诱导EMT发生的一系列转录因子，包括HIF-1α、STAT3、Notch1、β-catenin、NF-κB和c-Jun，都在调节CSC中起着关键作用[35]。HES1基因是参与CSC自我更新的关键Notch通路靶点，HIF1α通过拮抗HES1基因的自动调节来增强Notch诱导的HES1表达，HIF-1α/Notch1通路对于维持常氧下血液系统恶性肿瘤中的CSC必不可少，为靶向CSC治疗血液系统恶性肿瘤提供了有效的方法[36]。Krüppel样转录因子2(Krüppel-like factor 2,KLF2)是一种肿瘤抑制因子，调节肿瘤细胞的生长、凋亡和血管生成等生物学过程。HIF-1α可介导包括结直肠癌在内的多种癌基因的进展，抑制HIF-1α可抑制人结直肠癌细胞的增殖，逆转结直肠癌细胞的多药耐药。HIF-1α可以与Notch靶基因结合来调节其在癌症干细胞中的信号传递。Notch-1信号还促进结直肠癌的肿瘤形成，保护细胞免于凋亡。KLF2可通过抑制HIF-1α的表达来抑制Notch1的表达，并且HIF1α/Notch1信号参与了KLF2对结直肠癌细胞的作用[37]。

HIF-1α在低氧应激下驱动肿瘤细胞的一系列细胞过程，包括糖酵解转换、细胞周期进展、血管生成和其他侵袭性行为，在许多类型的癌症中其过度表达与不良预后相关。核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)的过表达促进了MCF-7和MADMB-231细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)和HIF-1α的表达。依赖于Nrf2的G6PD/HIF-1α的激活通过上调Jagged1和HES1的表达来激活Notch1的表达。Notch信号通路通过影响其下游基因HES-1来影响乳腺癌的增殖，并通过影响EMT通路的表达来调控乳腺癌细胞的迁移[38]。二氯化钴(CoCl2)诱导HIF-1α的表达，刺激Notch1信号分子的激活，在转录和翻译水平上上调Snail的表达，从而增加人胰腺癌细胞MiaPaCa2细胞的侵袭力[9]。靶向HIF-1α/Notch1通路是一种潜在的抑制缺氧诱导的EMT增加和侵袭的治疗策略。

4 结 语

缺氧是一系列疾病的重要生理特征，包括癌症、心血管疾病和卒中等。缺氧通过影响基因表达在这些疾病的病理过程中起着积极的作用，从而使缺氧信号通路成为发展新的分子治疗方法的关键目标。其中HIF-1α与Notch1信号的串扰发生在多种生理及病理过程中，包括生长发育、EMT、血管生成及肿瘤转移的发生等，然而HIF-1α与Notch1相互作用的具体机制仍未被完全阐明。另外，应对缺氧微环境的信号因子也不仅仅是HIF-1α与Notch1，对缺氧的具体调节机制仍然比已知的更广泛和更复杂，同时也不确定慢性缺氧下哪种机制起主导作用。然而，考虑到HIF-1α与Notch1两信号之间相互作用参与缺氧的发生过程中，以多条信号通路为靶点可能是更有效的改善缺氧的潜在性可行策略，多种HIF-1α与Notch1的抑制剂在动物模型中起作用，然而将来最困难的挑战是将这些有希望的策略转化为临床试验并进一步应用于临床。缺氧可能是多种慢性疾病的关键致病机制，靶向缺氧介导的过程可能在设计新的干预策略以缓解或延缓疾病的进展和改善临床预后方面具有一定前景。