远隔缺血适应渐进模式对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响研究*

张国明 丁立成 孙广峰 留志贤 王斌 孙媛媛

（厦门大学附属心血管病医院 福建 厦门 361009）

随着急诊冠脉介入治疗的发展，缺血再灌注损伤已经成为急性心肌梗死治疗最后的堡垒，细胞凋亡是引起心肌组织缺血再灌注损伤的主要因素[1]，因此，抑制再灌注时细胞凋亡能够有效防治心肌缺血再灌注损伤。多项研究已经证实缺血后适应可有效降低心肌细胞凋亡，但鉴于临床使用的局限性，有很多学者提出了远隔器官适应，即肢体远隔缺血适应[2]，能够有效减少实验大鼠心肌梗死面积，以减轻再灌注使对心肌组织的损害。但是目前临床或动物实验研究中，尚无标准的远隔缺血时适应方案，远隔缺血时适应效果与心肌缺血发生后至适应开始的时间、适应处理过程中每次短暂缺血-灌注时间及其循环次数等因素密切相关[3]。鉴于损伤和治疗中渐进模式能减缓变化过程，从而给予此变化过程一个缓冲的理念，本研究提出了渐进远隔时适应的概念。本研究选取60 只实验大鼠开展分组研究，以探析远隔缺血时不同适应渐进模式对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌的保护作用。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料 60 只SD 雄性大鼠，体质量200～250 g，自由饮食水，饲养室内温湿度适宜，12 h/12 h 明暗周期环境。TUNEL 细胞凋亡试剂盒（北京微旋基因技术有限公司）；线粒体通透性转换孔道（MPTP）检测试剂盒（沪震生物）；VIS-721N 紫外可见光光度计（棱光）；单克隆抗体信号传导及转录活化因子（p-STAT3）、单克隆抗体JAK 激酶2（p-JAK2）、蛋白激酶B 单克隆抗体（p-AKT）、单克隆抗体信号调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）（艾美捷科技）。

1.2 试验分组 采用随机数字表法，将60 只大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注对照组、标准机械后适应组、标准远隔时适应组、正向渐进模式远隔时适应组、负向渐进模式远隔时适应组六组，每组10只。

1.3 心肌缺血-再灌注损伤模型建立 心肌缺血再灌注损伤大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥钠（70 mg/kg），颈部皮肤常规消毒，纵向切开暴露第2 和第3 个气管环。行气管切开术，气管插管，连接呼吸机。机械通气参数设置为，呼吸频率65 次/min，潮气量2.5 ml/100 g，呼吸比1:1。然后在大鼠右后肢和左前、后肢放置心电图电极进行心电图监测。同时充分暴露大鼠右侧颈总动脉，插入22G 套管针并连接动脉压仪，连续测量大鼠颈动脉血压。将大鼠左侧胸壁消毒，从胸骨左缘沿胸骨方向切开皮肤至第5 肋间水平，钝性分离并切至第4 肋间肌。撕开心包显露心脏，5-0 缝线从左心耳中点下缘进入左冠状动脉前降支左侧，从右侧出针，深度1 mm。然后在缝合线的两端各穿一根1 cm 的缝合线，以防止缝合线脱落。在心肌表面与缝合线之间放置1 mm 棉包肝素盐水，结扎左冠状动脉前降支。再向下推连接管，用棉絮压左冠状动脉前降支，用血管钳阻断左冠状动脉前降支的血流，实现缺血。松开血管钳可恢复冠状动脉左前降支再灌注。

1.4 干预方法

1.4.1 假手术组 假手术组大鼠建模，但常规开胸后分离左冠状动脉和左侧股动脉并穿线后不结扎，40 min 后关闭大鼠胸腔。

1.4.2 缺血/再灌注对照组 冠脉实施40 min 缺血后即完全松开阻塞球囊恢复完全再灌注，分离左侧股动脉并穿线后不结扎。

1.4.3 标准机械后适应组 冠脉实施40 min 球囊阻塞缺血后，每隔30 s 松开阻塞球囊30 s，共3 次，至恢复完全再灌注；分离左侧股动脉并穿线后不结扎。

1.4.4 标准远隔时适应组 冠脉实施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松开阻塞球囊恢复完全再灌注，分离左侧股动脉并穿线，在冠脉结扎时结扎股动脉5 min，而后再灌注5 min，反复进行4 个循环。

1.4.5 正向渐进模式远隔时适应组 冠脉实施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松开阻塞球囊恢复完全再灌注，分离左侧股动脉并穿线，在冠脉结扎时结扎股动脉1 min，而后再灌注4 min。而后按照2/3 min、3/2 min、4/1 min、4/1 min、3/2 min、2/3 min、1/4 min反复进行8 个循环。

1.4.6 负向渐进模式远隔时适应组 冠脉实施40 min 球囊阻塞缺血后即完全松开阻塞球囊恢复完全再灌注；分离左侧股动脉并穿线，在冠脉结扎时结扎股动脉4 min，而后再灌注1 min。而后按照3/2 min、2/3 min、1/4 min、1/4 min、2/3 min、3/2 min、4/1 min反复进行8 个循环。

1.5 观察指标

1.5.1 比较各组大鼠心肌梗死范围 各组大鼠予以相应干预后，在其左心室推注4 ml 伊文思蓝以对心脏非缺血区（蓝色）和缺血危险区（无蓝色）进行鉴别。经大鼠右颈总动脉注射10%氯化钾溶液2 ml 将大鼠处死，即刻取出心脏，冲洗干净并剪除右心室、右心房，冰冻20 min，左心室从心尖到心底横向切片。置于0.05%NET 磷酸盐溶液中浸泡20 min，再用4%多聚甲醛固定。拍照计算梗死范围，即梗死面积之和占总面积的比值。

1.5.2 比较各组大鼠心肌细胞凋亡率 采用TUNEL 法，用TUNEL 细胞凋亡试剂盒检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况，严格根据说明书进行操作。凋亡率为每张切片中凋亡心肌细胞个数占所有心肌细胞个数的比值。

1.5.3 比较各组大鼠心肌组织MPTP 开放程度 先用差速离心法将心肌组织线粒体提取出来，再用紫外可见光光度计测量吸光度初值（△A1），予以MPTP 检测试剂盒诱导MPTP 开放，再次测量吸光度值（△A2）。MPTP 开放程度由△A 表示，△A=△A1-△A2该值愈小，提示开放程度愈大[4]。

1.5.4 比较各组大鼠心肌细胞内p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 的蛋白表达水平 采用蛋白免疫印迹（Western blot）法测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 软件分析数据。计量资料以（±s）表示，两组对比用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死范围、 心肌细胞凋亡率及MPTP 开放程度比较 与缺血/再灌注对照组相比，标准机械后适应组、标准远隔时适应组、正向渐进模式远隔时适应组、负向渐进模式远隔时适应组的心肌梗死范围、心肌细胞凋亡率更低，△A 值显著升高；且正向渐进模式远隔时适应组心肌梗死范围、心肌细胞凋亡率低于其他组，△A 值显著高于其他组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死范围、心肌细胞凋亡率及MPTP 开放程度比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注对照组比较，#P＜0.05；与标准机械后适应组比较，△P＜0.05；与标准远隔时适应组比较，▲P＜0.05；与负向渐进模式远隔时适应组比较，▽P＜0.05。

组别 n 心肌梗死范围（%） 心肌细胞凋亡率（%） △A假手术组缺血/再灌注对照组标准机械后适应组标准远隔时适应组正向渐进模式远隔时适应组负向渐进模式远隔时适应组10 10 10 10 10 10 FP 6.78±0.63 29.08±2.73*17.08±1.80*#17.20±1.64*#15.14±1.25*#△▲▽18.39±0.87*#190.280 0.000 5.84±0.71 26.19±3.23*17.04±2.04*#16.65±2.32*#13.06±0.94*#△▲▽16.63±2.01*#102.631 0.000 0.37±0.02 0.13±0.02*0.21±0.03*#0.26±0.02*#△0.30±0.02*#△▲▽0.26±0.03*#△127.384 0.000

2.2 各组大鼠心肌组织p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、 p-ERK1/2 蛋白表达水平比较 蛋白印迹检测结果显示，正向渐进模式远隔时适应组的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表达水平较假手术组外的其他组显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与缺血/再灌注对照组比较，#P＜0.05；与标准机械后适应组比较，△P＜0.05；与标准远隔时适应组比较，▲P＜0.05；与负向渐进模式远隔时适应组比较，▽P＜0.05。

组别 n p-STAT3 p-JAK2 p-AKT p-ERK1/2假手术组缺血/再灌注对照组标准机械后适应组标准远隔时适应组正向渐进模式远隔时适应组负向渐进模式远隔时适应组10 10 10 10 10 10 FP 1.22±0.09 0.29±0.04*0.61±0.07*#0.63±0.10*#0.82±0.07*#△▲▽0.63±0.06*#173.713 0.000 1.07±0.10 0.23±0.03*0.41±0.07*#0.38±0.06*#0.47±7805*#△▲▽0.41±0.05*#215.768 0.000 0.44±0.02 1.41±0.06*1.90±0.13*#1.86±0.09*#2.03±0.08*#△▲▽1.89±0.08*#508.525 0.000 0.64±0.08 1.79±0.12*2.29±0.12*#2.32±0.13*#2.48±0.11*#△▲▽2.34±0.14*#350.308 0.000

3 讨论

急性心肌梗死后的缺血再灌注损伤是困扰临床工作的重要难题之一，其机制主要是再灌注后心肌组织内释放大量氧自由基、中性粒细胞浸润，致使心肌细胞膜结构受到破坏，心肌组织受损[5]。2003 年Zhao 等[6]学者提出缺血后处理概念，即在冠脉再灌注治疗开始时实施短暂性的、反复开通以及再关闭，逐渐恢复冠脉血流，这对于改善心肌组织再灌注损伤有显著的效果。但缺血后适应在临床应用过程中窗口期较短，且冠脉局部处理在手术过程中存在一定风险，因此有学者提出了在其他部位进行后处理的方法，即远隔适应。

有研究[7]发现，远隔缺血时适应与远隔缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的心肌保护作用相似。远隔缺血时适应主要是在心肌组织发生缺血后，且在心肌再灌注治疗前实施干预措施，给临床治疗提供了足够的操作时间，且具有良好的安全性。最新临床荟萃分析[8]显示，远隔缺血时适应能够降低急性心肌梗死病人心肌标记物水平，从而改善预后。也有学者[9]发现，在远隔缺血时适应处理过程中短暂性灌注、短暂性缺血的时间关系是可相互影响的。鉴于所有的病理损伤和治疗过程如果给予渐进处理，都会为变化过程带来缓冲，从而可以减弱不良反应的理念，本研究对不同远隔缺血时适应渐进模式进行比较，结果显示，正向渐进模式远隔时适应组的心肌梗死范围、心肌细胞凋亡率显著低于假手术组外的其他组，因为正向渐进模式在缺血和再灌注两个阶段都提供了正向的渐进过程，从宏观上讲更符合渐进适应的过程。

在具体机制方面，再灌注损伤补救激酶（RISK）、生存活化因子增强（SAFE）途径和线粒体途径是心肌缺血-再灌注损伤发生的主要信号通路[10～11]。其中，RISK 信号通路磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）主要通过激活下游效应器，以降低再灌注损伤引起细胞凋亡发生。SAFE 信号通路在心肌缺血再灌注损伤中也发挥着保护作用，主要通过介导JAK2/STAT3信号从细胞膜往细胞核中转导，以调节蛋白表达，减少炎症介质释放[12]。本研究中，正向渐进模式远隔时适应组的p-STAT3、p-JAK2、p-AKT、p-ERK1/2 表达较假手术组外的其他组显著提高，提示正向渐进模式能够通过RISK、SAFE 通路调节炎症介质释放，从而使正向渐进模式组的MPTP 开放程度低于其他组，从而减轻了心肌缺血再灌注。

综上所述，正向渐进远隔时适应模式可以发挥较传统标准模式更好的心肌保护作用，其作用机制可能与激活RISK 和SAFE 途径，抑制MPTP 开放有关。