Parkin及其底物在线粒体功能障碍相关疾病中的研究进展

张晓放，陈士玲，芦小单

(1.长春中医药大学临床医学院，长春 130117； 2.吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春 130021；3.长春师范大学生命科学学院，长春 130032)

线粒体功能障碍是神经退行性疾病、肥胖、糖尿病以及肿瘤等重大慢性病的发病基础。Parkin作为E3泛素连接酶在细胞质中处于自抑制状态，但在环境变化引起线粒体自噬的情况下，细胞质中的Parkin被激活并被招募到线粒体上，通过人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin途径介导细胞线粒体自噬，促进线粒体质量控制[1-3]。Parkin蛋白是一个多功能的蛋白，除了泛素连接酶的作用外，还具有转录调节因子的功能，且在不同的疾病中功能不同。目前，神经退行性疾病帕金森病(Parkinson′s disease，PD)的病因及发病机制一直是科学研究的热点，以往认为，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径损伤是其主要原因[4]。近年在PD患者大脑病变相关的路易小体中发现，Parkin活性受损，从而导致其底物蛋白[氨酰基转运RNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白2(aminoacyl transfer RNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2，AIMP2)]蓄积，提示AIMP2作为Parkin的作用底物与路易小体包涵体的形成相关，故开发靶向AIMP2聚集的化合物可能具有治疗PD的潜力[5-6]。此外，Parkin参与线粒体的选择性降解，在青光眼的研究中发现Parkin对视网膜神经节细胞起到保护作用[7]。在肥胖与糖尿病中，过量的葡萄糖会发生氧化应激，诱导线粒体DNA病变，线粒体自噬减少。研究发现，中药黄芪甲苷、线粒体抗氧化剂可调节PINK1/Parkin的表达，逆转高血糖诱导的线粒体异常状态[8]。在肿瘤的研究中，Parkin除了抑制丝氨酸合成及糖酵解途径外，对肿瘤的生长也具有抑制作用[9-10]。在PARK2基因突变或缺失导致的疾病中，因Parkin缺乏导致其相应的作用底物异常积累。现就Parkin及其底物在线粒体功能障碍相关疾病中的研究进展予以综述。

1 Parkin概述

1.1Parkin的结构 1998年在研究常染色体隐性遗传的PD时，研究者发现了Parkin基因，并将其命名为PARK2[11]。PARK2位于第6号染色体长臂第2区第5条带的第2个亚带到第7条带，包含12个外显子，长度约为1.5 Mb[1]。Parkin蛋白由465个氨基酸组成，分子量为52 000，广泛表达于各种组织，最初有关其在大脑与肌肉组织中的研究较多，近年学者们开始关注其在脂肪组织与心脏组织中的功能[2]。在未激活状态下，Parkin由六部分组成：N端类泛素Ubl结构域、独特的RING0结构域、典型的RING1结构域(通常与E2酶结合)、催化结构域RING2、RING1结构域和RING2结构域之间的IBR结构域以及分离IBR结构域和RING2结构域间的阻遏子REP区域[12]。

1.2Parkin的底物 近年来，关于细胞自噬和线粒体自噬的研究广泛开展。研究发现，通过线粒体外膜蛋白泛素化降解诱发线粒体自噬作用的底物主要有线粒体外膜孔蛋白[13-14]、线粒体前体蛋白导入受体TOMM70A、线粒体融合蛋白1/2、线粒体裂变蛋白FIS1、动力蛋白相关蛋白1、线粒体外膜蛋白mitoNEET、己糖激酶1和2、线粒体Rho GTP酶1、Bcl-2相关X蛋白等[15]。Hattori和Mizuno[15]对Parkin功能进行研究发现，其中被Parkin多泛素化降解的底物有电压依赖性阴离子通道蛋白1、线粒体Rho GTP酶1、线粒体融合蛋白1/2、己糖激酶1等。这些Parkin作用底物主要为线粒体外膜蛋白，但目前关于Parkin与线粒体内膜蛋白作用的研究较少，还有待进一步探索。

1.3Parkin的作用机制 正常生理情况下，Parkin的Ubl结构域和REP连接体在空间上阻碍了RING1结构域上的E2泛素连接酶的结合位点，且催化位点RING2被RING0封闭，使整个Parkin蛋白处于非激活状态[16]。在环境变化引起线粒体自噬的情况下，RING2和E2的活性位点结合，Parkin被激活[17-18]。锚定在线粒体上的PINK1通过磷酸化作用，将激活状态下的Parkin招募到线粒体上，启动线粒体自噬的过程。另外，由于Parkin的结构中含有RING1结构域，故除了与蛋白底物作用外，Parkin还具有DNA结合能力，可以同时表现出转录因子和泛素连接酶功能[19]。与此类似，RBCK1(RANBP2-type and C3HC4-type zinc finger containing 1)、E3泛素连接酶RAD18和MDM2(murine double minute 2)三种蛋白也具有直接结合DNA的能力和泛素连接酶的特性[20]。Parkin在缺氧的环境下会被招募至细胞核，与转录因子雌激素相关受体α相互作用以增强其转录活性，以直接或间接的方式调控机体能量和代谢过程。同时，Parkin表达增加能够保护细胞线粒体毒物、内质网应激和蛋白毒性应激等诱导的细胞死亡[19]。在调节线粒体自噬的基础上，Parkin可能具有更加复杂多样的功能。在氧化应激、缺氧、线粒体DNA损伤等不同条件下，Parkin可能通过不同方式介导细胞器维持或降解的过程[12]，因此未来的研究需更加关注细胞和体内的生理应激源。

2 Parkin与线粒体功能障碍相关疾病

2.1Parkin与PD PD是一种慢性神经退行性疾病，由大脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性缺失引起，以形成细胞内的蛋白质包涵体为病理特征[21]。有学者对PARK2基因突变患者的神经元模型进行研究发现，PARK2基因突变与线粒体DNA稳态的受损相关[4]。目前，研究正在探索靶向特定PARK2基因突变诱导的功能障碍的治疗方法。一种线粒体的小分子激活剂正在临床前开发中，它能够直接激活Parkin/PINK1或抑制泛素特异性蛋白酶30[22]。有研究认为，由于PARK2基因突变的PD患者中以青少年较为多见，且合并症的发生率较低，在治疗上更适合选用多巴胺能细胞替代疗法[23-24]。在PD患者大脑中还发现，形成路易小体的α-突触核蛋白聚集与AIMP2相关，AIMP2作为Parkin的赖氨酸48泛素底物，被多聚泛素化[5]。因此，在关于路易小体形成的研究中，将AIMP2与PD的病理联系确定为该蛋白作为Parkin的毒性底物在PD患者大脑中积累。且Parkin活性受损，导致其底物蛋白AIMP2蓄积，而液泡分拣蛋白35调节AIMP2的溶酶体降解，因而液泡分拣蛋白35的活性可能是防止AIMP2异常蓄积及其与α-突触核蛋白共聚集的关键[5]。Lee等[25]通过实验证明，成年小鼠Parkin的缺失可能会触发γ-突触核蛋白的聚集并伴随AIMP2的积累，随后被重新分配到不溶性隔室中，但是在发育过程中的某些综合机制可能掩盖了PD的病理表现，因为在成年小鼠中Parkin缺失会导致进行性多巴胺能神经元丢失。这些体内研究表明，衰老或其他疾病过程可能通过影响蛋白质质量控制或其他调节γ-突触核蛋白稳定性的信号转导通路共同促进γ-突触核蛋白的聚集。而抑制AIMP2聚集的化合物可能在调节PD中AIMP2-α-突触核蛋白的聚集方面作为治疗安全有效的靶点[6]。同时，AIMP2在临床疾病诊断方面也发挥重要作用，Kim等[7]首次提出，Parkin和AIMP2的信使RNA表达水平可作为诊断PD的潜在生物标志物。

因此，线粒体自噬功能障碍在PD发病机制中起重要作用，而Parkin作为线粒体自噬途径的关键调节因子，以PINK1/Parkin泛素化降解途径为中心对Parkin及其底物进行研究对于了解PD的病理机制、早期诊断以及治疗靶点的选择具有重要意义。

2.2Parkin与肥胖及糖尿病 2型糖尿病是一种慢性多系统疾病，表现为胰岛素抵抗和(或)胰岛素分泌不足。尽管线粒体功能障碍在糖尿病相关并发症的发生中至关重要，但与癌症和神经退行性疾病相比，其在糖尿病肾病中的机制研究更深入[4，10，26]。与其他肾脏结构相比，肾脏的近曲小管中存在的线粒体数量较多，近曲小管对ATP的依赖性较大，由于肾脏对线粒体的依赖性更高，成为功能最活跃、能量依赖的器官之一[27]。除了线粒体的功能和形态变化外，糖尿病肾脏显示出功能失调线粒体的积累，这表明负责线粒体质量控制的机制失调，导致线粒体清除受损或异常线粒体的产生，因此控制线粒体平衡的机制在糖尿病肾病的管理中可能发挥关键作用[28]。在高血糖情况下，过量葡萄糖发生氧化还原反应，导致线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ的电子泄漏，线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ被认为是线粒体中活性氧类的主要来源，而活性氧类的累积效应破坏了线粒体的抗氧化功能，导致氧化应激[29]。同时，活性氧类进一步导致核转录因子红系2相关因子2活化并易位至细胞核，与抗氧化反应元件结合，引起编码线粒体超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等的基因转录水平上调，影响氧化还原状态，因此核转录因子红系2相关因子2降解导致高血糖肾近曲小管细胞线粒体去极化和葡萄糖摄取受损[30]。研究发现，系统性线粒体功能障碍和葡萄糖诱导的线粒体DNA改变导致糖尿病肾病[29]。所以，线粒体分裂受损、线粒体生物合成受阻和能量缺乏是糖尿病肾病期间线粒体自噬减少的指标。传统中药黄芪甲苷可以改善线粒体质量控制，对2型糖尿病继发的糖尿病肾病具有肾脏保护作用。有学者发现，对db/db糖尿病模型小鼠给予黄芪甲苷可抑制线粒体动力相关蛋白1、线粒体裂变1和线粒体融合素基因2的表达，并下调PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，防止糖尿病肾病进展[8]。另外，通过腹膜内注射线粒体抗氧化剂可提高核转录因子红系2相关因子2活性和PINK/Parkin的表达水平，逆转高血糖诱导的线粒体异常状态，恢复db/db小鼠肾小管细胞的缺陷性线粒体自噬[31]。

Parkin突变或缺乏与PD的遗传性和散发性形式有关，在PD人群中2型糖尿病的发病率更高。有遗传数据表明，PD与2型糖尿病之间存在关联[32-33]。Parkin是维持线粒体稳态的关键因素之一，Parkin功能缺失会导致胰岛β细胞中胰岛素产生和分泌受损，以及对链脲佐菌素诱发的糖尿病敏感性增加[33]。在脂肪组织研究中发现，Parkin介导的线粒体自噬在体内米色脂肪细胞的维持中起重要作用，在PARK2基因敲除小鼠的白色脂肪组织中，CL316,243刺激能够生成富含线粒体的米色脂肪，但由于在此状态下线粒体降解途径受到抑制，米色脂肪不能向白色脂肪转变[34-35]。在诱导分化的脂肪细胞中，激活蛋白激酶A信号能够显著降低羰基氰化物间氯苯腙诱导线粒体招募Parkin的效率，这一过程是通过对Parkin的磷酸化作用进行调控，且不依赖于线粒体解偶联蛋白1的表达[34]。在糖尿病环境中，线粒体动力学的微调平衡受到干扰，在糖尿病肾脏中，功能失调的线粒体异常积累加重。这种功能失调线粒体的积累表明，线粒体自噬受损或该过程不能满足受损线粒体的清除。因此，需对影响线粒体自噬促进质量控制的因素和在糖尿病环境中改变引起线粒体功能受损的通路进行研究。关于Parkin机制的研究，对于肥胖和2型糖尿病治疗靶点的选择具有重要意义。

2.3Parkin与肿瘤 细胞需要产生能量来维持生命，癌细胞的快速增长和增殖对能量的需求较大。以往研究表明，Parkin蛋白对多种肿瘤具有抑制作用[36]，但目前文献报道许多癌症与Parkin基因突变相关[26]。来自cBioportal(http://www.cbioportal.org)的数据库分析表明，Parkin基因突变率在宫颈癌中约为5%，在肺鳞癌中约为5%，在结直肠癌中为2%～6%[26]。PARK2基因的缺失或突变常发生在肺癌中，PARK2的失活导致肺癌的发病率增加。通过分析癌症基因组图谱发现，约1/4的胶质母细胞瘤样品具有Parkin基因的杂合或纯合缺失和点突变[26]。在乳腺癌中，同样观察到Parkin的杂合性缺失和拷贝数缺失[10]。近年研究表明，代谢关键酶——磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH)在某些类型的癌症中常过表达，其过表达可以激活丝氨酸合成以促进癌症进展[37-38]。Liu等[37]发现，Parkin是PHGDH的E3泛素连接酶。Parkin在赖氨酸330处泛素化PHGDH，导致PHGDH降解以抑制丝氨酸合成和肿瘤发生[35]。大量研究表明，Parkin作为肿瘤抑制因子，其在许多癌症(包括40%～70%的乳腺癌和超过30%的肺癌)中的表达被下调，而这种下调可能是由不同的机制引起，包括杂合性丧失、拷贝数丢失和启动子高甲基化PARK2[36，39-40]。除了抑制丝氨酸合成外，研究还显示，Parkin可抑制糖酵解[9-10]。但Parkin在抑制糖酵解中的功能机制尚不清楚，这可能与其在缺氧诱导因子-1α泛素化中的活性以及对磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号的抑制有关[10，39]。以上研究表明，Parkin在调节细胞代谢中的作用有助于抑制肿瘤发展。未来，PHGDH抑制剂的开发对Parkin缺乏相关的癌症具有潜在的治疗意义。

3 小结与展望

Parkin作为HECT结构域E3泛素连接酶，正常生理情况下处于自抑制状态。随着代谢生物学的迅速发展，Parkin作为调控线粒体自噬的关键调节因子在肥胖、糖尿病、肿瘤等代谢性疾病中也受到越来越多的关注。在Parkin的结构域中，对RING1和Ubl结构域的研究较为深入，当Ubl结构域受到磷酸化激活时，Parkin才具有泛素连接酶的催化作用和转录因子的调控作用。在未来的研究中，揭示Parkin其他4个结构域的功能及作用机制将会对重大慢性病治疗起到重要的推动作用。此外，研究转录因子参与调控Parkin表达、线粒体蛋白介导的PINK1/Parkin参与线粒体自噬以及Parkin参与线粒体和内质网互作的机制，能够揭示生命能量代谢的时空网络调控过程，并在神经和代谢性疾病的诊断与治疗中发挥重要作用。