基于肝星状细胞调控的肝纤维化治疗机制相关研究概述

牛媛媛，汪龙德，毛兰芳，胥文娟，张萍，符博雅

(1.甘肃中医药大学，兰州 730000； 2.甘肃中医药大学附属医院消化科，兰州 730020)

肝纤维化是由多种复杂病因引起的慢性肝损伤所致的以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白)过度净积累而形成的纤维性瘢痕，进而取代受损的正常组织为特征的一系列动态过程[1]。多数学者认为，肝纤维化由肝毒性损伤和胆汁淤积损伤两种类型的慢性肝损伤所引起[2]。在严重且持续的病理刺激下，肝纤维化可发展为更严重的肝硬化，若肝腺泡被结节取代，则进一步恶化为肝细胞癌。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)最早于1876年由Carl-von Kuffer提出，其明确定位于窦周隙的内皮下，大致分布在肝窦内皮细胞与肝细胞之间，约占所有常驻肝细胞的10%[3]。正常情况下，HSCs表现为持久稳定的静止型，以血管周围脂质液滴的存在和薄突起延伸为特点，但其在受损肝脏中激活可促进胶原蛋白分泌和纤维瘢痕组织形成，进而导致慢性肝纤维化或肝硬化[4]。越来越多的证据表明，肝损伤或体外培养后HSCs被激活，从静止的、维生素A储存细胞转分化为具有增殖、收缩、纤维形成、基质降解改变、趋化性和炎症信号的肌成纤维化细胞样细胞类型，被认为是实验性和人类肝损伤启动肝纤维化的关键驱动因素[5]。大量动物实验和临床研究数据显示，在肝纤维化消退过程中，损伤因素消失且积极有效治疗肝组织的纤维化进程可减缓甚至逆转[6]。值得注意的是，通过细胞凋亡或表型转化(恢复到静止状态)来减少活化的HSCs数量在肝纤维化逆转过程中具有重要地位[7]。此外，HSCs的活化受限、免疫清除和衰老也参与活化HSCs的清除[8]，理论上，上述调控机制可发挥抗肝纤维化作用，从而抑制或逆转肝纤维化的发生和发展[9]。现对HSCs调控的肝纤维治疗机制的相关研究予以综述，以期为慢性肝病的防治提供新思路。

1 HSCs激活前的干预阶段

在肝损伤过程中，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1等细胞因子通过旁分泌等方式激活HSCs，而TGF-β1的产生可以促进并维持一个自分泌循环中胶原蛋白基因的表达，同时上调金属蛋白酶组织抑制剂的表达，导致ECM沉积和纤维化[10]。肝纤维化进程中的各个重要环节及作用靶点离不开多种信号通路的参与及综合调控。如姜黄素可通过调控TGF-β/Smad2信号通路升高过氧化物酶体增殖物激活受体γ水平，降低血小板源性生长因子、TGF-β1及其相应受体和Ⅰ型胶原蛋白的水平，对HSCs的活化起重要的反向作用[11]。此外，α干扰素可抑制HSCs激活，其作用机制主要依赖于脂质过氧化产物水平的降低以及与细胞氧化活性迸发，进而调控HSCs阻断或逆转肝纤维化进展[12]。自噬作为肝脏代谢稳态的纽带，对维持肝脏正常生理功能有重要意义，病理因素刺激下，自噬可通过裂解细胞质滴内的视黄醇酯产生脂肪酸，驱动HSCs的激活。相关研究发现，在自噬调节因子、自噬相关蛋白7 特异性缺失小鼠中，外源性四氯化碳的诱导作用不变，而纤维形成和ECM积累显著减少[13]。采用自噬抑制剂-巴菲霉素A1处理HSCs可明显降低细胞增殖活力和HSCs激活相关标志物的基因表达[14]，提示可通过调控细胞自噬抑制或预防HSCs的激活，进一步减少促使肝纤维化发生或加重病理组织损害，缓解疾病程度，这可作为抗肝纤维化研究的新切入点。

充足的物质能量供应是机体赖以生存和繁衍的必要前提，而HSCs的激活需要持续且不间断的细胞内能量供应，若细胞内能量供应失衡或停滞，则ECM的合成与分泌受阻。在一项相关临床前研究中，溴丙酮酸(亚致死剂量的能量阻滞剂)可通过干扰能量代谢促进活化的HSCs表型改变，进而减少ECM的分泌[15]。在未来精准医疗实施的大背景下，能量阻滞剂的应用可能是多种疾病(包括心力衰竭)的有价值的治疗靶点之一。

Hedgehog (Hh)通路是一个由配体、受体和转录因子组成的多功能复杂系统。当Hh配体与补丁同系物结合时，光滑的同系物被激活，进而启动信号并进一步驱动靶基因的转录，包括调控细胞存活、增殖、迁移和分化的骨桥蛋白[16]。研究表明，基于Hh通路的药理学和遗传学方法可以减少肝纤维化和HSCs活化[17]。与野生型小鼠相比，缺乏蛋氨酸和胆碱喂养的补丁同系物杂合子小鼠Hh通路的激活在一定程度上增强，骨桥蛋白表达增加，肝纤维化程度加重[18]。但另有研究显示，喂食蛋氨酸和胆碱缺乏饲料的骨桥蛋白缺乏小鼠的纤维化减少[19]，提示相同饮食诱导刺激下，Hh通路的激活与骨桥蛋白存在协同作用，对HSCs的活化状态及纤维化的发展进程有重要影响，而阻断活化的HSCs的Hh信号通路可作为抗肝纤维化的治疗策略之一。

2 HSCs激活后的中间阶段

2.1促进HSCs表型转化 表型转化可使活化的HSCs恢复到静止状态，进而减少纤维化前细胞因子的分泌和ECM的沉积[20]。然而，去活化的HSCs并不会完全恢复到此前的绝对静止状态，而是处于预先激活的中间状态，在某种程度上此中间状态更易受到后续的损伤刺激。Andrade等[21]研究发现，Ecto 5-核苷酸酶通过腺苷一磷酸的衰减和腺苷脱氨酶活性的降低，调节活化的HSCs进入静止状态。相关证据指出，纤溶酶原可以恢复静止的HSCs表型，主要通过对非纤维蛋白基质成分的蛋白水解起作用[22]。即使在肌成纤维细胞被激活的情况下，HSCs也可通过上调抗凋亡基因Hspa1a/b恢复静息样表型[23]。Moran-Salvador等[24]指出，通过协同下调促皮质素和脂氧合酶的表达，上皮细胞生长因子和纤维细胞生长因子可使活化的HSCs恢复中间状态。但HSCs激活状态的鉴定及评估与表型逆转的系统调控仍有待进一步深入研究。肝纤维化的主要决定因素、基因表达、表观遗传机制包括DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白翻译后修饰，在一定条件下可使HSCs保持部分静止状态[25]。综上所述，控制失活HSCs稳定性及可逆性、恢复HSCs静止状态、避免有害刺激引起肝损伤发作的方法均需要进一步研究。

2.2免疫清除 病理损害过程中，HSCs启动主动选择程序，通过促进炎症细胞的募集放大受损肝脏的炎症反应，而免疫细胞可通过减少活化的HSCs数量对上述过程产生拮抗作用，甚至逆转肝纤维化[26]。胶原酶活性的增加是纤维化消退的主要途径之一，在纤维组织分解阶段，活化的巨噬细胞通过分泌基质金属蛋白酶发挥重要的调节作用[27]。一方面，巨噬细胞可全方位增加基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达，进而促进肌成纤维细胞凋亡；另一方面，巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用可诱导纤维化模型中基质金属蛋白酶的表达，并增强ECM的降解[28]。自然杀伤细胞(natural killer cells，NK细胞)和NKT细胞是淋巴细胞，它们可以合成和分泌多种细胞因子，并在状态激活后直接杀伤或消灭HSCs[29]。此外，NK细胞还可诱导早期活化和衰老的HSCs凋亡，主要通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体介导的途径或在未完全激活HSCs中表达维甲酸早期诱导1来实现[30-31]。另有相关证据指出，NKT细胞也可改善肝纤维化程度，这与其通过释放白细胞介素-30选择性清除活化的HSCs密不可分[32]。CD4+T淋巴细胞(包括辅助性T细胞1、辅助性T细胞2、辅助性T细胞17和调节性T细胞)是目前已知的重要免疫应答调节剂之一，其通过不同途径对损伤应激产生直接或间接影响，最终促进肝纤维化静默[33]。Reifart等[34]的研究发现，肝组织在缺血再灌注损伤情况下，内源性大麻素受体CB-1和CB-2的参与可使HSCs的CD4+T细胞减少或失去活性。活化T细胞产生的白细胞介素-22可通过诱导白细胞介素-10R2和白细胞介素-22R1的表达，增加衰老相关-半乳糖苷酶的数量与活性，诱导活化的HSCs衰老，这对改善肝纤维化具有积极而深远的影响[35]。需要特别强调的是，共同的信号刺激和免疫检查点之间的平衡决定了细胞毒性 T细胞的激活和免疫反应强度[36]，在此基础上通过激活T细胞诱导的HSCs衰老可能成为治疗肝纤维化的新策略。但上述推测需要大量临床前和临床试验的验证，机体免疫系统及多种细胞因子的交互作用在清除活化HSCs方面具有重要作用。

3 HSCs衰退的后期阶段

3.1促进HSCs凋亡 细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在肝纤维化发展过程中HSCs的增殖和凋亡可维持HSCs数量的平衡，一旦HSCs动态平衡被打破，细胞凋亡便可抑制甚至消除HSCs的激活[37]。在急性肝损伤中，未完全激活的HSCs可以通过细胞凋亡被消除，但这种机制并不能完全恢复肝组织的完整性，故应将这种渐进性伤害控制在一定范围内，以防止肝损伤进一步恶化[38]。Elsharkawy等[39]对HSCs凋亡在逆转肝纤维化中的作用和调控的研究发现，实验性增强HSCs凋亡可促进纤维化消退，说明死亡受体配体、细胞外基质成分和免疫调节因子、信号转导蛋白与转录因子等的协同作用可延缓纤维化进程。研究表明，经传统工艺进行修饰的改良柑橘果胶可通过抗氧化活性和抑制半乳糖凝集素-3诱导HSCs凋亡，进而阻止肝纤维化进展[40]。薯蓣皂苷通过调节TGF-β1/Smad、Wnt/β联蛋白、促分裂原活化的蛋白激酶以及线粒体信号通路诱导HSCs凋亡，发挥抑制肝纤维化的作用[41]。相关研究发现，在某种程度上，丹参酮Ⅱa通过诱导DNA断裂、聚酯纤维聚合酶和胱天蛋白酶3裂解、提高B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白/B细胞淋巴瘤-2蛋白比例促进线粒体膜去极化以及细胞色素C在细胞质中的释放，显著诱导S期细胞周期阻滞，下调细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白依赖性激酶，从而促进HSCs的凋亡，逆转或阻滞肝纤维化的发展[42]。研究证实，HSCs凋亡离不开可溶性生长因子和细胞因子、纤维基质成分和死亡受体等的刺激，以及多种信号通路介导的调节[43-44]。因此，HSCs作为肝纤维化发生发展的效应细胞，其表型的动态变化及任何环节的波动均在肝纤维化防治中起重要作用，提示关注与调控HSCs凋亡的相关基因及多种新信号通路之间串扰的综合调节可为研发新的抗纤维药物提供参考靶点。

3.2诱导HSCs衰老 与细胞凋亡不同，细胞衰老是一种由基因控制的机体生理功能的自然衰退，它可在有限的增殖能力内限制细胞分裂，以防止基因损伤细胞的过度积累[45]。一项关于非人类灵长类动物衰老的肝窦假毛细血管化的研究显示，衰老的狒狒并没有表达与年龄密切相关的HSCs激活的标志物，表明衰老的人类或其他非人类灵长类动物的HSCs并没有被激活[46]。此外，停止增殖的衰老HSCs仍可增强NK细胞功能、促进免疫细胞募集、加速免疫细胞清除，同时上调基质降解酶表达，下调ECM蛋白表达，使ECM的合成与降解达到动态平衡，有助于逆转肝纤维化过程[47]。p53/p21通路介导的细胞衰老抑制了活化的HSCs的增殖能力，使小鼠肝纤维化程度降低[48]，提示通过不同方式及手段诱导HSCs衰老可能是抗纤维化的策略。富半胱氨酸蛋白61通过活性氧类诱导的细胞衰老、凋亡及TGF-β信号的衰减方式，在原发性门静脉肌纤维的成纤维细胞中发挥抗纤维化作用[49-51]。另有研究表明，塞来昔布衍生物OSU-03012通过诱导衰老抑制HSCs的增殖和活化[52]，提示临床用药的多元性及多学科交叉融合将为抗肝纤维化的治疗提供新思路及新方法。

4 小 结

调节HSCs可以预防和治疗肝纤维化，其方式包括抑制HSCs的激活、促进HSCs表型转化、免疫清除、促进HSCs凋亡及诱导HSCs衰老等综合调控。此外，目前纤维化研究的主要焦点之一是开发具有高肝特异性的靶向治疗(包括活细胞、磁性颗粒或受控磁力)，这种治疗可耐受并促进多余间质基质的降解与清除，其可能成为逆转肝纤维化的有效手段之一。然而，免疫细胞、细胞因子治疗、特异性基因调控诱导细胞凋亡的能力还有待进一步研究。目前学者对肝纤维化研究的多集中于HSCs的活化及其表型转归，而忽略了维持肝脏正常生理功能对肝纤维化治疗的意义，因此相关研究应注意两者的有机统一，以全面了解疾病发病机制、治疗策略及患者预后。