新型鹅细小病毒病研究进展

2022-12-07刘明生甘辉群傅宏庆钟美娟

现代畜牧兽医 2022年2期

刘明生，甘辉群，吴双，傅宏庆，钟美娟

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

新型鹅细小病毒病是由新型鹅细小病毒（novel goos e parvovirus，NGPV）引起的一种病毒性传染病，又称短喙侏儒综合征（short beak and dwarfism syndrome，SBDS），主要感染樱桃谷北京鸭、番鸭、半番鸭等。新型鹅细小病毒病临床可表现为短喙、舌头外伸、腿骨易折断、生长发育受阻、死亡等，其病原除NGPV外，还包括新型番鸭细小病毒（novel muscovy duck parvovirus，NMDPV）、鸭圆环病毒（duck circovirus，DCV）等。

1971 年，法国率先报道了新型鹅细小病毒病，之后在我国台湾地区以及波兰、匈牙利相继出现相关报道[1-2]。2015年，我国福建、江苏、山东等地区的一些商品肉鸭群中出现鸭喙变短、长舌、生长迟缓等症状的“鸭大舌病”，经病原分离鉴定证实该病为新型鹅细小病毒病[3-4]。本文综述新型鹅细小病毒的病原学特征、分子生物学特征、临床诊断特征和检测技术等方面的相关研究，以期为新型鹅细小病毒病的综合防控提供技术支撑。

1 病原学特征

NGPV 属细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、依赖病毒属（Dependovirus），为二十面体对称的球形或六角形、无囊膜、单链DNA 病毒，直径为20～25 nm[5-6]。与其他病毒相比，该病毒体积相对较小，结构较简单。NGPV 一般无法在PK-15、DF-1、BHK-21 等常用的细胞系上生长增殖，但可采用鸭胚、鹅胚[7-8]或其原代成纤维细胞分离。病毒初期对鸭胚致死率低，一般需要盲传几代后才可导致鸭胚出现死亡；死亡时间多发生于接种病毒后96～120 h，表现为胚体头颈部、胸腹部、腿部和翅下出血，病毒滴度（ELD50）可达10-5.5～10-4.2/0.2 mL[9-10]。贾婧宇等[8]从分离得到3 株NGPV，结果发现，3 种NGPV 均能够在鹅胚中稳定传代，但致死鹅胚的时间明显长于经典型鹅细小病毒（GPV）。

2 分子生物学特征

2.1 基因组结构

NGPV的基因组序列约为5.1 kbp[5,7,10-11]。郑肖强[12]分离得到的NGPV SDLC01 株基因组全长5 006 bp，基因组两侧为末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），长度约为444 个核苷酸（nucleotide，nt）。ITR 区含有大量核苷酸为4～10 bp的短小重复序列，利于病毒复制、转录以及克隆载体拯救。基因组中间部分含左、右两个开放阅读框（open reading frame，ORF），ORF中间由18个碱基隔开；其中，左侧ORF 能够编码NS1 和NS2 非结构蛋白，右侧ORF则可编码VP1、VP2和VP3等3种结构蛋白。

非结构蛋白NS1，又称为Rep1 蛋白，是在NGPV 病毒粒子复制早期时产生的一种具有调节作用的磷酸化蛋白，参与病毒的DNA 复制、诱导细胞的病理变化以及基因的转录调控等[13]；含有ATP酶活性结合点、4个保守的解旋酶活性碱基，具有与ATP 结合或与DNA 定向结合并切割等多种生物学功能[14]。

非结构蛋白NS2，又称为Rep2蛋白。NGPV分离株的NS2基因核苷酸与GPV分离株同源性很高，对细小病毒的毒力无太大影响[12]。但NS2 蛋白能够增强NS1 蛋白的细胞毒性作用，与病毒DNA的合成、增殖以及蛋白质的有效合成有关[15]。Cotmore 等[16]发现，缺失NS2基因的病毒在合成病毒衣壳蛋白时影响病毒的组装。

结构蛋白是病毒衣壳的组成成分，包括VP1、VP2、VP3，长度分别为2 199、1 764 和1 605 bp[12]。结构蛋白具有各自的转录起始位点，但具有共同的转录终止位点。其中，VP1结构蛋白影响病毒的感染过程；VP2结构蛋白参与病毒颗粒的细胞核输出，能够刺激机体产生保护性抗体；VP3含有细小病毒主要的抗原决定簇，构成鹅细小病毒的保护性抗原，是细小病毒主要的结构蛋白[17]，参与病毒感染宿主细胞环节。

曹旭阳[14]采用PCR扩增NGPV的VP3基因，连接至原核表达载体pCold-TF，转化入E.coliBL21感受态细胞，高效表达重组蛋白VP3，采用Western blot和间接免疫荧光进行鉴定，表明重组蛋白VP3可与新型鹅细小病毒的特异单抗发生特异性免疫反应。

2.2 核苷酸序列

2015 年，NGPV 引起SBDS 发病。不同NGPV 的分离株间全基因序列相似性为99.2%～99.7%，与经典的鹅细小病毒（GPV）核苷酸同源性达92%以上，与番鸭细小病毒（MDPV）核苷酸同源性普遍低于90%[8,11,18-20]。贾婧宇等[8]分离得到的3 株NGPV 基因组的同源性为98.9%～99.7%，与经典GPV强毒株的同源性为95.2%～96.1%。

李琦等[10]对分离的新型番鸭细小病毒DS15株进行全基因序列分析，结果发现，新型番鸭细小病毒DS15 株与NGPV SDLC01 株同源性为99.8%，与其他GPV 同源性达92.6%～97.2%，与番鸭MDPV 同源性为81.2%～85.4%。葛志琪[11]对分离的NGPV 四川株SC16株进行基因组核苷酸同源性分析，结果显示，NGPV 四川株SC16 株与SDLC01及QH15 株的同源性均高达99%。吴蓓[18]分离的NGPV DZ-01株的全基因组序列与其他NGPV相比，其同源性达99.3%～100.0%，其中，DZ-01 与QH15 株、SDLC01 株同源性分别为99.7%和100.0%；与MDPV 相比，同源性最高仅为85.0%。

殷冬冬等[19]分离鉴定了1 株NGPV AH-D15 株，对其VP3基因进行测序，结果发现，AH-D15株核苷酸同源性与经典GPV相比，同源性达93.3%～96.5%，亲缘关系较近；与MDPV 同源性为81.6%～81.7%，亲缘关系较远。宁康[20]通过对11份NGPV 阳性样品基因序列分析，结果发现于443 bp的VP1和495 bp的VP3区，其所测毒株间的核苷酸序列同源性均达100%，与经典GPV 毒株核苷酸同源性分别为95%～99%和96%～99%。

2.3 NGPV关键突变位点分析

贾婧宇等[8]基于3 株NGPV 与已发表的NGPV 毒株和经典GPV 强毒株的编码蛋白比对分析显示，与国内经典GPV强毒株相比，NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸点突变，其中9个氨基酸位点与欧洲的B株相同；非结构蛋白Rep1 则产生了12 个氨基酸位点突变，上述特征性氨基酸位点可能与GPV 从感染鹅转向感染新宿主樱桃谷鸭相适应。宁康[20]研究表明，北京鸭源GPV的非编码区存在碱基突变和插入或缺失，但对结构形成无影响；NS蛋白编码区含9个共性氨基酸突变，可能与GPV对北京鸭的致病性有关；VP1蛋白含5个共性氨基酸突变，但这些突变均远离可能的受体吸附位点，不影响病毒与受体的结合。

3 临床诊断特征

3.1 流行病学

NGPV 的易感动物主要包括3 周龄以内的樱桃谷鸭、北京鸭、半番鸭、高邮鸭、台湾白鸭与金定鸭等肉鸭，发病率为10%～30%，部分品种可高达50%；自然感染病死率一般低于5%，人工感染病死率则可达25%。NGPV能够通过接触传播和垂直传播，病毒广泛存在于鸭心、肝、脾、肺、肾等器官。

傅宏庆等[6]证实，NPGV可感染高邮鸭、金定鸭与苏邮1 号鸭，发病率100%，死亡率10%～25%。吴蓓[18]研究表明，可从感染NGPV 的患鸭的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、胰腺、胆汁、法氏囊等9个脏器中检出病毒，病毒核酸检出率最低为肺脏（15.0%），最高为心脏（82.5%），平均检出率为45.0%；鸭群的阳性检出率为62.5%～100.0%，平均检出率达82.5%。宁康[20]采集了来自不同地区8 个孵化场的1 日龄北京鸭样品40份，经检测发现GPV阳性样品为35份，阳性率达87.5%，结果表明，NGPV病毒可经卵垂直传播。

3.2 临床症状

樱桃谷鸭、北京鸭等商品肉鸭感染NGPV 后，患鸭表现鸭喙短缩、舌头外伸、胫骨变脆、跛行瘫痪、生长迟缓、体重减轻、腹泻拉稀及腿翅易断等。NGPV可造成患鸭采食困难，料重比增加，降低养殖经济效益[3]。NGPV发病率与日龄存在一定关系，发病鸭群日龄越小，发病率越高。

陈浩等[3]将分离鉴定的NGPV SDLC01 株感染1 日龄雏鸭，结果表明，GPV SDLC01 毒株可引起患鸭上下喙萎缩、舌头外伸、体温升高、排白色或黄白色稀便，部分患鸭出现运步困难、跛行或瘫痪等症状；发病率5%～20%，严重者高达40%，但患鸭病死率较低；患病鸭日龄多为13～40 d，体重减轻20%～30%，严重者可减轻50%。刘荣昌等[5]测量患病的3个半番鸭群与同场的外观正常鸭的体重、喙长、喙宽，结果显示，与正常鸭相比，发病鸭体重减轻49%，喙长缩短32%，喙宽缩短22%。

李琦等[10]使用鸭胚传代尿囊液接种雏鸭，结果发现，雏鸭表现喙变短、舌头外伸的临床症状。袁万哲等[21]以口服和肌肉注射的方法，将分离鉴定的SD1株病毒的第5代尿囊液分别接种于10日龄的北京4系与樱桃谷肉鸭，结果表明，感染组鸭群出现体重减轻、胫骨较脆等症状，部分樱桃谷肉鸭表现喙萎缩、舌头外伸等症状，并能够从感染组鸭群的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、舌中检出鸭细小病毒。张锦玥[22]采用肌肉注射的方法，将分离鉴定的NGPV SD15株接种于40只1日龄樱桃谷鸭，结果表明，与对照组相比，感染6 w后，感染组鸭的体重减轻18.5%，喙长缩短10.7%。

3.3 病理变化

患病鸭通常表现为上下喙短缩，舌头僵硬而不灵活，可向外伸出1～3 cm。患鸭骨骼发育异常，全身骨质疏松、骨质脆弱，容易断裂；胸腺萎缩,出现散在的针尖状出血；心肌出现少量出血点，肝脏轻微出血，患鸭胸腺髓质的胸腺小体出血，胸腺皮质出血少见，心肌颗粒变性，骨骼肌出血，肌纤维断裂，发凝固性坏死，肝细胞呈水泡变性[5]。

陈浩等[3]光学显微镜下观察了短喙长舌综合征患鸭的舌、胸腺、肾脏等器官的组织病理学变化，结果发现，患鸭舌间质性炎症，结缔组织基质疏松、水肿，胸腺水肿，胸腺髓质淋巴细胞与网状细胞散在性坏死，存在大量炎性细胞浸润，组织间质出血，肾小管上皮细胞崩解凋亡，管腔狭小、水肿，间质出血，并伴有大量炎性细胞浸润。张锦玥[22]通过HE 染色观察组织病理学变化，发现感染组鸭的肝细胞轻度水肿、空泡变性，脾脏髓质区脾小体明显减少，淋巴细胞明显减少。张欣欣[23]研究发现，鸭感染鸭源新型鹅细小病毒可造成肠绒毛严重受损、肝细胞变形坏死，肾小管呈空泡化。

4 检测技术

新型鹅细小病毒的检测方法为核酸探针检测方法、半套式PCR、套式PCR、荧光定量PCR、实时等温环介导扩增方法、间接ELISA方法等。

郑肖强[12]建立了地高辛标记核酸探针检测方法，该法敏感性好，最低检测量为25 pg，与其他常见鸭源病毒无杂交反应，特异性强。高莎莎[24]建立了半套式PCR 检测方法，对鹅细小检测阳性的病料进行检测验证，结果表明，半套式PCR 检测法的检出率为73.3%～93.3%。Li 等[25]建立了双重半巢式PCR检测方法，可同时鉴别检测经典鹅细小病毒和新型鹅细小病毒。周洁文等[26]建立了检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，结果显示，在5.17×101～5.17×107copies 范围内呈良好的线性关系，相关系数R2为0.999、斜率为3.595，灵敏度可达5.17 copies。

曹旭阳等[27]建立了TaqMan 荧光定量PCR 方法，结果表明，此方法检测敏感性达37.2 copies/μL，与常规PCR 相比，灵敏度高100倍，具有良好的特异性，批内和批间的检测变异系数均不大于2.2%；对收集的50份病料进行检测，荧光定量PCR方法NGPV检出率为78%，普通PCR方法为50%。Yang等[28]建立了实时等温环介导扩增方法，结果表明，该法灵敏度高，最低检出量为100 copies，是普通PCR灵敏度的100倍。

王燕[29]建立了基于VP3 蛋白检测新型GPV 抗体的间接ELISA方法，研究表明，该法有高灵敏度和特异性，待测血清10 240 倍稀释后仍可检出GPV 特异性抗体。刘铭等[30]建立了间接ELISA方法，其检测临界值为0.445，该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，临床样品的阳性检出率为93.3%。

5 防控技术

目前尚无针对SBDS 的商品疫苗，本病的防控主要依靠对1～7日龄雏鸭注射小鹅瘟卵黄抗体，但并不具有良好的预防、治疗作用。

刘铭等[31]采用自制的新型鸭细小病毒（SD株）疫苗免疫蛋鸡，采用水稀释-硫酸铵二次沉淀法制备了大量纯净的卵黄抗体，效价达1∶10 000，为新型鸭细小病毒病的防治提供了新思路。有研究人员采用传统鸭胚或鸭胚成纤维细胞培养病毒制备灭活疫苗，通过免疫种鸭的方式使雏鸭获得母源抗体[32]。与抗体产品相比，该产品保护率高、母源抗体持续时间长，仅免疫母鸭可节约劳动力和成本，具有一定优势。但全病毒灭活疫苗开发难度较大、成本高，更适宜的防治方式仍有待探索。