薯蓣皂苷激活PERK-Nrf2-HO-1通路改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗的机制探究

徐在革，敖 文，黄 婷，刘惠双

0 引言

糖尿病是一种常见的、由多种病因引起的慢性代谢性疾病，其典型特征是血糖较高，无法正常转化，从而引起机体长期糖代谢紊乱，导致眼、心脏、肝脏、肾脏等组织器官出现功能减退、衰竭等情况，对机体的危害非常严重[1-2]。胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是指在一些因素的影响下，机体对于胰岛素的敏感度减弱，导致葡萄糖的摄取和利用率降低，是糖尿病和代谢综合征的重要致病因素之一[3]。薯蓣皂苷一般是从薯蓣科植物中提取的，具有抗炎、降血压、降低胆固醇等多种功效，广泛用于心脑血管疾病、糖尿病和肿瘤等疾病的治疗中[4-6]。本研究探讨薯蓣皂苷通过调控PERK-Nrf2-HO-1通路改善糖尿病小鼠IR的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重23～25 g，购于河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0001。饲养环境：室温20～26 ℃，湿度40%～70%，光照条件12 h/12 h光暗循环。适应5 d后进行实验，期间饮食正常。

1.2 主要试剂、仪器 薯蓣皂苷(批号：20210120)购于西安斯诺特生物技术有限公司；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)、HE染色试剂盒(G1120、G1121)购于北京索莱宝科技有限公司；小鼠空腹胰岛素(Fasting insulin，FINS)ELISA试剂盒(FT-P9S2076X)购自上海梵态生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)(S0088)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)(S0131S)和活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)(S0033S)试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；兔抗Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(14796)、兔抗Nrf2 (20733)、兔抗PERK(3192)、兔抗HO-1(82206)、兔抗cleaved caspase-6(9761)、兔抗β-actin(4970)、山羊抗兔IgG (7074)购于CST公司；三诺GA-3型血糖仪购于上海聚慕公司；Nikon Ti-S显微镜购于日本Nikon公司；光学显微镜购自上海豫光仪器厂；Alpha View凝胶成像仪购于苏州阿尔法生物实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病小鼠模型的构建 雄性小鼠先用高脂饲料连续喂养30 d，然后只给饮水，禁食24 h。之后连续1周每天进行STZ(40 mg/kg)腹腔注射(STZ采用0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液溶解配置)。结束腹腔注射后7 d测定小鼠的空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)情况，小鼠FBG>11.1 mmol/L时，可认为模型构建成功。

1.3.2 分组与处理 随机选取正常喂养的9只小鼠作为对照组，喂养普通饲料，腹腔注射0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液。将成功构建糖尿病模型的45只小鼠按照随机数字表法分为5组：糖尿病组，薯蓣皂苷低、中、高剂量组，二甲双胍组，每组9只。薯蓣皂苷低、中、高剂量组分别灌胃25、50、100 mg/kg薯蓣皂苷；二甲双胍组小鼠灌胃100 mg/kg二甲双胍；对照组和糖尿病组则灌胃等量生理盐水，每日1次，连续30 d。

1.3.3 各组小鼠FBG、FINS、胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)及体重的检测 在连续给药完成后，小鼠禁食禁水12 h，测定其体重。之后静脉取血1.5 ml，离心机中3 000 r/min 4 ℃的条件离心15 min，取血清，在-80 ℃条件下保存备用。使用血糖仪测量FBG水平，使用ELISA法测定FINS水平，计算HOMA-IR。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.3.4 各组小鼠肝脏组织HE染色 各组小鼠处死之后，取肝脏组织。将右上叶使用4%甲醛固定，其余部分-80 ℃冻存备用。将4%甲醛固定的肝脏组织样本经石蜡包埋后切片(3 μm)，将肝脏组织切片脱蜡、水洗后行HE染色、封片，使用显微镜观察肝脏组织病理形态变化。

1.3.5 各组小鼠肝脏组织中SOD活性及MDA和ROS水平的检测 取上述冻存备用的肝脏组织1 g，采用PBS(9 ml)制备组织匀浆，离心后取上清液进行检测。根据SOD、MDA和ROS试剂盒说明书进行实验操作，绘制相关标准曲线，并计算出SOD活性、MDA和ROS含量。

1.3.6 各组小鼠肝脏组织凋亡指数检测 取上述肝脏组织的石蜡切片，按照TUNEL试剂盒操作步骤进行，之后使用光学显微镜观察细胞核，细胞核着色呈棕黄色或棕褐色的细胞为凋亡细胞。使用双盲法观察，并进行细胞凋亡指数(Apoptopic index，AI)的计算。AI(%)=凋亡细胞/总细胞×100%。

1.3.7 各组小鼠肝脏组织中Bax、cleaved caspase-6、PERK、Nrf2及HO-1的蛋白表达 取上述冻存备用的肝脏组织，使用RIPA试剂盒提取总蛋白，并测定蛋白浓度。蛋白中加入上样缓冲液混匀后100 ℃ 5 min使蛋白变性；上样20 μg/孔，10% SDS-PAGE凝胶电泳，100 mV 2 h；半干法转膜，100 mA 1 h；TBST溶液室温洗膜15 min；Blocking one/Blocking one-P封闭30 min，一抗(1∶1 000稀释)孵育，4 ℃过夜；洗膜后二抗(1∶10 000稀释)孵育，室温1 h；洗膜后，ECL发光液室温反应1 min，凝胶成像系统成像，并分析蛋白条带。

2 结果

2.1 各组小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR及体重比较 与对照组相比，糖尿病组小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR均明显提高(P<0.05)，而小鼠体重明显降低(P<0.05)。与糖尿病组相比，薯蓣皂苷低、中、高剂量组和二甲双胍组小鼠FBG、FINS水平和HOMA-IR均降低(P<0.05)，小鼠体重增加(P<0.05)，且薯蓣皂苷组的作用效果具有一定的剂量效应关系，而二甲双胍组与薯蓣皂苷高剂量组相比，作用效果差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠FBG、FINS水平、HOMA-IR及体重比较

2.2 各组小鼠肝脏组织病理学情况 与对照组比较，糖尿病组小鼠的肝组织细胞形态异常且不规则、细胞排列凌乱，而且出现了较多空泡和坏死的现象。而在薯蓣皂苷各剂量组和二甲双胍组中，无论是细胞形态、结构,还是排列顺序,较糖尿病组均有明显改善，尤其是薯蓣皂苷高剂量组和二甲双胍组。见图1。

图1 各组小鼠肝脏组织病理学情况(HE，200×)

2.3 各组小鼠肝脏组织中SOD活性、MDA及ROS水平的变化情况 与对照组比较，糖尿病组SOD活性明显降低(P<0.05)，MDA和ROS水平则明显升高(P<0.05)。与糖尿病组相比，薯蓣皂苷各剂量组和二甲双胍组SOD活性明显升高(P<0.05)，MDA和ROS水平明显降低(P<0.05)，且薯蓣皂苷的作用效果具有一定的剂量效应关系。二甲双胍组与薯蓣皂苷高剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 各组小鼠肝脏组织细胞凋亡情况 与对照组比较，糖尿病组AI明显升高(P<0.05)。与糖尿病组相比，薯蓣皂苷低、中、高剂量组和二甲双胍组AI明显降低，且薯蓣皂苷的作用效果具有一定的剂量效应关系(P<0.05)。二甲双胍组AI略高于薯蓣皂苷高剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图2。

表2 各组小鼠肝脏组织中SOD活性、MDA和ROS水平及AI的变化情况

图2 各组小鼠肝脏组织细胞凋亡情况(TUNEL，200×)

2.5 各组小鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-6表达水平 与对照组相比，糖尿病组Bax、cleaved caspase-6在蛋白水平的表达明显升高(P<0.05)。与糖尿病组相比，薯蓣皂苷低、中、高剂量组和二甲双胍组Bax、cleaved caspase-6蛋白表达均明显降低(P<0.05)，且薯蓣皂苷的作用效果具有一定的剂量效应关系。薯蓣皂苷高剂量组和二甲双胍组Bax、cleaved caspase-6蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3和图3。

图3 各组小鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-6表达情况

表3 各组小鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-6表达水平

2.6 小鼠肝脏组织中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平 与对照组相比，糖尿病组PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与糖尿病组相比，薯蓣皂苷低、中、高剂量组和二甲双胍组PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显提高(P<0.05)，且薯蓣皂苷的作用效果具有一定的剂量效应关系。二甲双胍组与薯蓣皂苷高剂量组相比，作用效果差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图4。

表4 各组小鼠肝脏组织中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达水平

图4 各组小鼠肝脏组织中PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达情况

3 讨论

近年来，糖尿病的发生率越来越高，且呈现年轻化的趋势，预计到2045年糖尿病的患病率高达8.3%[7]，如何有效地治疗糖尿病成为研究热点。IR作为糖尿病的一个重要致病因素，一直以来都是治疗糖尿病的焦点[8]。然而，糖尿病治疗药物，如双胍类、噻唑烷二酮类等，虽然对IR具有较好的效果，但是也带来了诸多不良反应，如肝肾损伤、胃肠道不耐受等。因此，寻找既能够有效减轻IR，又具有较小不良反应的药物，对于糖尿病的治疗具有重要意义[9]。本研究中，与对照组比较，糖尿病组小鼠的体重下降，FBG、FINS水平及HOMA-IR明显升高，表明小鼠体内出现了IR。

肝脏参与糖代谢，是机体调节血糖浓度的重要器官，IR的发生与其有关。在糖尿病患者的血浆中，cleaved caspase-6表达明显升高，促进高糖诱导的足细胞凋亡，进而促进糖尿病肾病的发展[10-11]。本研究中，与对照组比较，糖尿病组小鼠肝脏组织中的细胞形态和结构变异，凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-6表达水平明显升高，肝细胞的凋亡指数明显升高，与上述研究结果类似。提示糖尿病会对肝脏组织造成损伤，引起肝细胞凋亡。肝脏组织损伤会影响肝脏的正常功能，从而导致机体血糖浓度失衡，加重糖尿病病情。因此，减轻肝脏组织损伤和肝细胞凋亡，有利于抑制IR[12]。本研究表明，薯蓣皂苷能够改善糖尿病小鼠肝脏组织细胞形态和结构的异常，降低Bax和cleaved caspase-6蛋白表达水平以及抑制细胞凋亡，且呈一定剂量依赖效应。本文研究结果显示，薯蓣皂苷对糖尿病小鼠的肝脏组织损伤具有改善作用，能够通过加强肝脏组织的功能，调节血糖浓度，抑制IR的发生。

氧化应激是导致糖尿病持续发生的一个重要病理因素，因此，抗氧化是减轻或缓解糖尿病的一个重要方向[13]。PERK-Nrf2是一条关键的抗氧化信号通路，在糖尿病及其并发症的治疗过程中具有重要作用。PERK是位于内质网上的一种跨膜蛋白，在受到刺激后会发生磷酸化从而被激活。Nrf2位于PERK的下游，是维持机体氧化还原平衡的一种重要转录因子，能够调控氧化应激反应，降低ROS等物质对细胞产生的损伤和对氧化应激反应的加重，促使细胞趋于氧化还原的正常状态[14-16]。当PERK被激活后，会进行信号传导，引起Nrf2蛋白的激活[17]，激活后的Nrf2会进入到细胞核内参与调控包括HO-1在内的抗氧化物的基因转录。HO-1是一种重要的抗氧化酶，能够抑制促氧化作用的发生，还能够对ROS等自由基进行有效清除，在抗氧化反应中起到重要作用[18-19]。本研究显示，当小鼠发生糖尿病时，肝脏组织中PERK、Nrf2、HO-1在蛋白水平的表达明显降低，而在薯蓣皂苷处理后，肝脏组织PERK、Nrf2和HO-1蛋白表达明显升高，提示PERK-Nrf2-HO-1通路参与了糖尿病的发生，而且薯蓣皂苷能够通过调控PERK-Nrf2-HO-1通路，来抑制氧化应激反应，达到减轻糖尿病小鼠肝脏损伤及IR的效果。

当机体出现氧化应激反应时，细胞内会有大量的ROS产生，这些ROS一方面能够过度消耗体内的抗氧化酶，如SOD[20]；另一方面又会对细胞中的脂质、蛋白质、核酸等大分子进行破坏，导致细胞凋亡，MDA是ROS过度氧化脂质的一种有毒产物[21]。因此，可以通过对SOD活性、MDA和ROS含量的测定来反映氧化应激的程度。本研究显示，薯蓣皂苷能够降低糖尿病小鼠肝脏组织中MDA和ROS含量，提高SOD活性。这提示薯蓣皂苷能够减少氧自由基堆积，提高抗氧化酶活性来发挥抗氧化作用，同时也反映了PERK-Nrf2-HO-1通路确实起到了调控抗氧化系统的作用。

综上所述，薯蓣皂苷能够通过激活 PERK-Nrf2-HO-1通路，抑制氧化应激反应和肝脏细胞凋亡的过度发生，进而发挥对糖尿病IR的减轻作用。薯蓣皂苷是否亦通过其他通路发挥对糖尿病小鼠的保护作用仍有待于后期深入探究。