环状RNA在老年神经系统疾病中作用研究进展

李欣 张金凤 宫萍

(吉林工程职业学院医护学院,吉林 四平 136001)

非编码(nc)RNA主要包括微小RNA(miRNA)，长非编码(lnc)RNA和环状(circ)RNA，在真核细胞转录组中占总RNA的95%〔1〕。circRNA由外显子，内含子或两者的反向剪接产生，以形成外显子或内含子circRNA〔2，3〕。circRNA转录本的最早是在30年前发现的，但当时被认为是RNA剪接错误的产物，近年来随着高通量测序技术及生物信息学方法的快速发展，并结合实验验证，但随着研究的深入，目前普遍认为circRNA在基因调控中具有重要功能〔4，5〕。Salzman等〔6〕针对癌症细胞系、非癌细胞系及急性淋巴细胞白血病患者的RNA样本进行RNA测序(RNA-Seq)以鉴定circRNA。这一研究首次鉴定出上万种内源性circRNA，这些circRNA与其线性对应物相比具有高度的稳定性〔7〕。与线性RNA不同，circRNA分子中的3′和5′末端通过共价键连接在一起，形成闭合的连续环状结构。这一特殊结构由于缺少游离末端，可防止其被RNA外切核酸酶降解，这一特点使得circRNA分子更加稳定，并且在细胞质中含量丰富并不断累积〔3〕。circRNA的表达水平具有组织特异性，在病理条件下，某些circRNA的表达水平明显失调，这引起了人们对其在人类疾病和癌症中作用的极大兴趣〔8〕。尽管circRNA的确切作用和其调控基因表达的机制仍有待阐明，但目前学界普遍认为，circRNA具有作为疾病生物标记物和新型治疗靶标的巨大潜力。

circRNA在神经组织中表达水平极其丰富，尤其在神经元细胞质中，并且在突触中积累。脑组织中约20%的编码基因都会产生其相对应的circRNA〔9〕，某些circRNA在大脑中的表达水平远远高于其他组织器官，甚至有些circRNA仅在大脑的特定区域中表达，这些circRNA会产生对于神经系统的特异性调节功能〔10〕，并且随着病理生理状态的不同而发生变化〔11〕。越来越多的证据表明circRNA在脑功能中起着关键的作用〔12〕，尤其在神经组织发育和衰老过程中发挥重要的调控作用，例如在响应神经元活动和突触形成过程中具有明显差异表达〔9，13〕，在衰老过程中大脑组织会大量积累circRNA分子〔14，15〕。衰老神经元中选择性剪接过程的异常可能是造成circRNA表达水平增加的重要因素之一，另外，circRNA能够抵抗核酸外切酶的特性可能是导致其在衰老脑组织中进一步积累的另一个重要因素。由于这些大脑特异性和与衰老相关的特征，人们对circRNA在迟发性神经退行性疾病中的作用越来越感兴趣〔16，17〕。考虑到circRNA的稳定性，它们还可以作为潜在的生物标志物和治疗靶标〔18〕。本文将总结研究circRNA及其在常见的老年性神经系统疾病中的作用及其作为生物标志物和治疗靶点的潜力。

1 circRNA的合成、降解、作用机制及主要功能

1.1circRNA的生物合成与降解 circRNA大致可分为三种类型：仅由外显子序列构成的外显子circRNA(EcircRNA)，这种类型占circRNA的绝大部分，主要存在于细胞质中；仅由内含子序列构成的内含子circRNA(ciRNA)及同时包含外显子和内含子序列的外显子-内含子circRNA(EIciRNA)，后两者主要存在于细胞核中。DDX39A和DDX39B是将形成的环状结构从细胞核输出到细胞质的蛋白质，较短的circRNA由DDX39A转运，较长的circRNA则由DDX39B介导进入细胞质〔19〕。CircRNA 的产生依赖于RNA结合蛋白(RBP)及顺式元件和反式因子的组合〔20〕。circRNA可以通过直接反向剪接过程产生，其中RNA的3′末端在前体mRNA的剪接过程中直接连接到5′末端，从而形成环状结构。在内含子互补序列驱动的反向剪接circRNA合成模型中，外显子两侧的内含子区域含有互补序列，这些互补序列配对紧密相连，促进反向剪接形成环状结构〔5〕。在RBP驱动的反向剪接circRNA合成模型中，在RBP的桥接作用下，外显子两端的剪接位点直接相连，促进反向剪接形成环状结构。在套索驱动的反向剪接circRNA合成模型中，在线性RNA剪接过程中被切断的RNA序列形成套索结构，然后通过反向剪接形成环状结构〔21〕。但是，circRNA具体的环化和线性可变剪接调节机制仍然有许多无法解释的问题。

由于circRNA独特的环状结构，它们无法通过常规的RNA降解途径被消除。circRNA的N6-甲基化修饰(m6A)可以被HRSP12蛋白识别，并与RNase P/MRP核酸内切酶复合物相互作用以触发circRNA降解〔22〕。有报道显示，miR-671可以与CDR1as上的保守结合位点具有高度互补性，并启动AGO2介导的降解过程〔23〕。此外，poly(I∶C)刺激或脑心肌炎病毒(EMCV)感染将病理性外源性双链RNA引入HeLa细胞并激活核糖核酸内切酶RNase L〔24〕。这种RNase L介导的circRNA降解需要蛋白激酶R激活，该激活由内部双链RNA形成调节，这种激活的RNase L会导致circRNA的整体降解。对于具有复杂二级结构的circRNA，高度结构化的区域可以被ATP依赖性RNA解旋酶UPF1及核酸内切酶G3BP1识别并诱导circRNA降解〔25〕。

1.2circRNA的调控机制及主要功能 目前针对circRNA研究最为深入的是其充当miRNA“海绵”的作用机制。CircRNA可以与miRNA的靶mRNA竞争性吸附miRNA，从而削弱miRNA介导的miRNA表达抑制〔26〕。Hansen等〔26〕首先通过CDR1as揭示了circRNA在脑组织中的miRNA海绵作用。CDR1as具有70多个miR-7结合位点，它还与作为miRNA调节剂的AGO蛋白结合。在这项研究之后，越来越多的研究进一步证明了circRNA充当miRNA海绵的作用〔27〕。这种机制在多个系统中发挥作用。除了circRNAs海绵性吸附miRNA的作用外，研究者们还进一步研究了circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA之间交互环的作用，以确定这些竞争性内源性RNA功能背后的潜在网络。除了充当miRNA海绵外，circRNA还可以通过直接结合蛋白质发挥其功能，从而充当蛋白质“支架”。CircRNA可以直接与一种或多种蛋白质相互作用，并充当动态支架来组装RNA-蛋白质复合物〔28，29〕。这种支架功能强调直接的蛋白质相互作用，这与其海绵性吸附功能不同，后者是指解离蛋白质或蛋白质与mRNA之间的结合。

Pamudurti等〔30〕首先发现circRNA能够进行翻译。生物信息学平台和计算分析表明，一些circRNA具有开放阅读框，因此具有翻译潜力。CircRNA的翻译机制可分为依赖内部核糖体进入位点(IRES)的翻译或不依赖IRES的翻译。CircSHPRH被证明以IRES依赖方式翻译为SHPRH-146aa多肽〔31〕。还有一些其他的 circRNA 被发现可以编码具有致癌或肿瘤抑制活性的功能性肽和蛋白质。一些circRNA以不依赖IRES的方式编码肽。例如，m6A修饰促进蛋白质翻译〔32，33〕。

2 circRNA在老年性神经系统疾病中的作用

2.1帕金森病(PD) PD在产生临床症状的数年前即开始病理性改变，其临床症状包括静息性震颤、运动迟缓、僵硬及非焦虑、抑郁、自主神经紊乱和神经认知功能下降等〔34〕。编码αSYN蛋白的SNCA基因突变是导致PD的分子机制之一，PD神经元中αSYN表达水平异常升高〔35～37〕。研究发现CDR1as可以通过海绵性吸附miR-7调控其靶基因SNCA，这表明CDR1as可能促进αSYN的异常表达，起到促进PD的作用〔38〕。另一项研究发现SNCA基因的环状产物circSNCA同样可以通过抑制miR-7的活性从而促进αSYN的异常表达〔39〕。使用多巴胺激动剂可以下调PD细胞模型中的circSNCA表达水平，从而导致miR-7上调和αSYN下调〔39〕。另一项针对PD小鼠模型和细胞模型的研究发现，circDLGAP4在PD中表达水平下调，其可能通过调节miR-134-5p促进PD的进展〔40〕。

近期的一项研究发现，在表达人类αSYN的转基因秀丽隐杆线虫模型中，来源于Zip-2基因的环状产物circZip-2表达水平明显降低，进一步的研究发现，circZip-2可能海绵性吸附miR-60，而miR-60可以抑制PD保护性基因〔41〕。由此可见，circZip-2可能在PD中具有保护作用，而circZip-2的缺失可能有助于αSYN聚集，进而促进PD发生。

氧化应激被认为是包括PD在内的许多神经退行性疾病的重要原因之一。CircSLC8A1在PD患者大脑组织的黑质纹状体中表达水平失调，并且在暴露于氧化应激诱导剂百草枯的培养细胞中表达水平显著升高〔42〕。CircSLC8A1包含7个miR-128结合位点，可与miRNA效应蛋白Ago2结合。Sirt1蛋白可以中和αSYN的神经毒性，对PD产生神经保护作用；它也恰好可以被miR-128靶向抑制，miR-128本身靶向几种与神经退行性和衰老调节剂高度相关的mRNA。因此，circSLC8A1可以通过海绵性吸附miR-128调节Sirt1等PD相关基因。

CircRNA还可能通过调节基因转录水平参与PD的发病和进展。CircDLGAP4在PD模型中下调并参与PD的病理生理过程，它可以通过海绵效应调节miR-134-5p的表达〔40〕，并进一步影响其靶标基因CAMP反应元件结合蛋白(CREB)，CREB是cAMP信号通路中的重要转录因子，可通过Ser133位点的磷酸化激活〔43〕。激活的CREB通过转录激活下游靶基因如Bcl2凋亡调节因子〔44〕、脑源性神经营养因子(BDNF)〔43〕和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子(PGC)-1α〔45〕。因此，circDLGAP4 可能通过调节 miR-134-5p/CREB通路参与PD的发病机制〔40〕。

除了探讨circRNA在PD致病机制中的作用以外，针对circRNA作为诊断和预测PD生物标志物的研究，也正受到越来越多的关注。最近的一项研究对60例PD患者和60名健康对照者的外周血单核细胞中的circRNA进行了对比分析，微阵列结果显示，6个circRNA在PD患者组中显著减少。为进一步评价差异表达的circRNAs对PD患者的诊断价值，采用受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUC)，统计结果显示，circ_0000497、circ_0000826、circ_0003848和circ_0126525在PD组中均显著下调，可用作PD诊断的生物标志物〔46〕。

2.2阿尔茨海默病(AD) AD是迟发性痴呆的最常见病因。AD最主要的神经病理学标志是β-淀粉样斑块和神经原纤维的积累。研究发现ciRS-7在AD患者的海马中表达水平下调〔47〕，如前文所述，ciRS-7可以通过海绵性吸附miR-7从而调节其生物活性〔48〕，其中泛素蛋白连接酶(UBE)2A的表达水平也受到miR-7的调节作用，UBE2A可促进β淀粉样斑块的清除。因此，ciRS-7表达水平降低可能增加β-淀粉样蛋白的沉积，从而促进AD发生。

针对AD死亡患者的脑组织RNA测序研究发现，9中circRNA与AD的诊断、临床痴呆评分(代表临床症状严重程度)和Braak评分(代表神经病理学严重程度)具有相关性，超过160种circRNA与至少1项AD症状具有相关性〔49〕。其中circHOMER1来自于Homer1基因，该基因编码一种涉及突触可塑性和神经元存活的蛋白质〔50〕。通过生物信息学分析发现，circHOMER1可以通过miRNA途径调控PSEN1&2蛋白的表达水平，从而影响淀粉样蛋白的沉积。值得注意的是，这些circRNA在大脑皮层不同区域的变化水平是相同的，这表明AD相关的circRNA变化可能在整个脑皮质中是一致的，并且可能在疾病进展的早期即发生表达水平的改变。Zhang等〔51〕应用生物信息学分析了来自多个大脑区域的4个AD RNA测序数据集并构建了circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络。结果表明，circRNA KIAA1586具有3个与AD相关的miRNA(hsa-miR-29b，hsa-miR-101，hsa-miR-15a)的结合位点，这些miRNA通过靶向PSEN2等多个mRNA，从而在AD中具有潜在的调控作用〔51〕。Wang等〔52〕通过向大鼠脑室注射β-淀粉样蛋白成功诱导出AD大鼠模型，通过对海马体RNA Microarrary数据的分析确定了在AD大鼠模型中差异表达的555个circRNA、183个miRNA和319个mRNA，并构建了circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络。在另一项研究中，Huang等〔53〕应用RNA Microarrary技术对散发性转基因AD小鼠模型进行了circRNA表达谱分析，通过进一步的RT-qPCR验证发现，circRNA_017963的表达水平变化最为显著。通过生物信息学构建circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络确定了至少5种可能与circRNA_017963结合的miRNA。进一步的GO分析和KEGG分析表明，这些miRNA参与了AD进展有关的多种生物学过程，如胞吐、突触小泡循环、凋亡和RNA剪接等。在淀粉样前体蛋白(APP)/早老素(PS)1转基因小鼠的大脑中发现，circTulp4是导致AD发展的潜在因素。CircTulp4通过与U1小核核糖核蛋白颗粒(snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ相互作用来调节其亲本基因TULP4的表达，影响神经元的生长和分化。在另一项研究中，研究人员对 8 个月大的APP/PS1小鼠海马中的circRNA-miRNA-mRNA调控网络进行了表征，并发现了一种新的mmu_circ_0003012/mmu-miR-298-3p/Smoc2信号轴，通过cGMP-PKG信号通路调控AD发生〔54〕。

除了探讨circRNA在AD致病机制中的作用以外，针对circRNA作为诊断和预测AD的生物标志物的研究，也正受到越来越多的关注。通过对8例AD患者和8名对照受试者的脑脊液中circRNA的表达模式的分析发现，AD患者中163个circRNA的表达水平显著失调，其中许多circRNA富集在AD经典的通路上，如自然杀伤细胞介导的细胞毒性、神经营养因子信号通路和胆碱能突触等。此外，该研究指出，circ-AXL、circ-GPHN和circ-PCCA是具有临床价值的潜在生物标志物，可用于预测AD的疾病风险和进展〔55，56〕。在对50例AD患者和50名对照受试者进行的对比研究中发现，AD患者的外周血中hsa_circ_0003391表达水平显著下调，并且其表达水平与AD的临床表现之间存在潜在的相关性〔57〕。

2.3肌萎缩侧索硬化症 肌萎缩侧索硬化症是一种进行性神经退行性疾病，会导致脑干和脊髓中的选择性运动神经元丢失。大多数患者发生肌萎缩侧索硬化症的原因尚不清楚，但之前的研究证实了融合肉瘤(FUS)基因的突变与家族性肌萎缩侧索硬化症的关系。目前对于circRNA在肌萎缩侧索硬化症发病机制中的作用的研究尚处于起步阶段〔58〕。该领域的第一项研究是由Errichelli等〔59〕在小鼠胚胎干细胞(ESC)衍生的运动神经元中首先进行研究。他们发现FUS通过与环状外显子相邻的内含子序列结合从而促进circRNA的合成。在FUS耗尽后，circRNA表达失调。FUS可以直接影响特定circRNA的生物合成，致病性FUS突变可能通过影响剪接调节的机制影响circRNA的生物合成。与FUS的功能类似，TDP-43也是一种定位于细胞核中的DNA和RNA结合蛋白。前脑TDP-43基因的条件性缺失小鼠模型证实，肌萎缩侧索硬化症相关的RBP对circRNA表达具有重要的调控作用，该小鼠表现出一系列额颞叶痴呆样异常行为。RNA-seq 数据显示，新皮质中的数百个circRNA在TDP-43敲除小鼠和对照小鼠之间有显著差异表达〔60〕。最近的一项研究表明，源自C9orf72的一段含有内含子G重复序列的RNA序列可以在细胞质中形成稳定的circRNA，在那里它可以作为含有二肽重复的蛋白质(DRP)翻译的模板，这也从侧面解释了C9orf72内含子导致肌萎缩侧索硬化症的机制〔61〕。

2.4多发性硬化症 多发性硬化症是一种复发性或进行性免疫介导的炎症性脱髓鞘疾病，其特征是少突胶质细胞的丧失。最近的一项研究表明，在多发性硬化症患者的白细胞中，超过400个circRNA的表达水平出现异常，其中大多数被下调〔62〕。各种ncRNA之间的相互作用也可能在调节多发性硬化症相关的可变剪接事件中发挥重要作用，例如，在多发性硬化症患者中上调的lncRNA可以调节剪接调控基因的表达，从而影响全局剪接和反向剪接过程〔63〕。其中lncRNAMALAT1参与调节49个circRNA的反向剪接和表达调控，从而导致多发性硬化症发病机制的异质性〔63〕。

2.5多系统萎缩 多系统萎缩是一种罕见的、散发的、进展迅速的神经退行性疾病，会影响身体的非自主功能，包括呼吸和血压〔64〕。多系统萎缩的许多症状与PD相似〔65〕。多系统萎缩患者大脑中的病理性αSYN 积累在多系统萎缩疾病进展中起主导作用〔66〕。有趣的是，多种circRNA如circRNA-IQCK、circRNA-MAP4K3、circRNA-EFCAB11、circRNA-DTNA和circRNA-MCTP1在多系统萎缩患者额叶皮质组织中表达水平显著升高，而它们的线性转录本没有改变〔67〕。这种差异还表明，circRNA 及其亲本线性RNA的表达在某些特定情况下是独立调控的〔68〕。值得注意的是，有一些热点基因可以产生不止一个circRNA，在针对多系统萎缩的转录组分析中就发现了21个类似的circRNA热点基因，这些热点基因都可以形成10个以上不同的circRNA〔67〕。然而，circRNA在多系统萎缩病理学中的确切作用尚未确定。

2.6脑卒中 在出现急性颈动脉相关缺血性脑卒中的患者血清样本中，circR-284与miR-221的概率升高，表明circRNA可以作为颈动脉相关性脑血管缺血的诊断标志物〔69〕。通过对短暂大脑中动脉闭塞6、12和24 h再灌注后的小鼠大脑中circRNA的表达情况的分析发现，与对照组相比，有283个circRNA的表达水平出现明显改变〔70〕。通过进一步的生物信息学分析发现，这些circRNA通过与蛋白质，离子和核酸的结合所参细胞代谢，细胞通讯等调控过程〔70〕。这项研究首次表明，circRNA对脑缺血敏感，其表达水平的改变可能与脑卒中后的病理生理改变相关。另一项相似的研究显示，在急性缺血性脑卒中患者和小鼠脑卒中模型的血浆中circDLGAP4水平显著降低，circDLGAP4可以通过海绵性吸附内源性miRNA-143抑制其活性，并导致miR-143靶标HECTD1基因的表达水平增加〔71〕。这两项最新研究均表明circRNA可能作为缺血性脑卒中治疗的靶标和疾病活动的标志物。

综上，circRNA参与了老年神经系统疾病的复杂病理生理调控过程。circRNA的异常表达，可能会导致神经退行性疾病的发展，但该领域尚缺乏系统的大规模人类样本研究。未来仍需要更多针对circRNA在神经退行性疾病和健康大脑中的作用的研究。未来的研究中建议同时囊括所有类型的调节性RNA(如circRNA，miRNA，lncRNA)及mRNA，并采取更为先进的circRNA数据分析和生物信息学算法，以全面了解其在老年神经系统疾病中的相互作用，同时阐明circRNA在健康和疾病中的作用及其潜在的诊断，预后和治疗用途。