抑制lncRNA DLX6-AS1通过靶向miR-200a减轻高糖诱导的足细胞损伤

刘文秀 吴彩斌 冯朵 王名姣

(榆林市星元医院内分泌肾病科，陕西 榆林 719000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的严重并发症，是终末期肾病的常见病因。足细胞是高度特化和终末分化的上皮细胞，覆盖肾小球基底膜表面，构成肾小球滤过屏障，在维持选择性肾小球滤过中起关键作用〔1〕。研究显示，DN发生时，除肾小球基底膜增厚、系膜扩张、肾小球硬化外，足细胞凋亡、结构功能改变在DN进展中具有重要作用，足细胞损伤是DN的早期病理表现〔2〕。因此，寻找抑制足细胞损伤的有效方法对DN的治疗具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是单链的、长度大于200个核苷酸的转录本，与包括DN在内的多种人类疾病发生发展密切相关〔3,4〕。研究显示DN患者肾组织、血清中DLX6反义RNA1(DLX6-AS1)表达上调，DLX6-AS1异常表达可能与DN患者肾功能下降、足细胞损伤有关，表明DLX6-AS1可能是DN发病机制中重要的调节因子〔5,6〕。然而，DLX6-AS1在DN中的确切作用并未完全阐明。本研究通过探讨DLX6-AS1在高糖诱导的足细胞损伤中的作用，阐明其分子机制，以期为DN治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 小鼠永生化足细胞购于中国典型培养物保藏中心；RPMI1640培养液、胎牛血清、青链霉素双抗溶液购于美国Hyclone公司；小鼠重组γ-干扰素购于美国Biovision公司；Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；DLX6-AS1小干扰RNA(si-DLX6-AS1)及其阴性对照(si-NC)、miR-200a模拟物(miR-200a mimics)及其阴性对照(miR-NC)、实验引物、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒由上海生工公司提供；PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒、SYBR Green Master Mix购于大连Takara公司；兔源含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、山羊抗兔IgG二抗购于上海碧云天生物公司。

1.2细胞培养和实验分组 复苏足细胞后，采用含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10 U/ml γ-干扰素的RPMI1640培养液在33℃、5% CO2培养箱中培养5 d。然后采用含10% 胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养10～14 d，使足细胞分化成熟。使用前将足细胞用无血清培养液饥饿处理24 h。分为正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高渗组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(25.0 mmol/L葡萄糖)，干预48 h后，按照下述实验方法检测肾病蛋白(nephrin)、结蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)、DLX6-AS1、miR-200a表达及足细胞凋亡情况。为验证DLX6-AS1调控miR-200a在高糖诱导的足细胞损伤中的作用，将足细胞分为以下几组。si-NC组(转染si-NC后进行高糖处理)、si-DLX6-AS1组(转染si-DLX6-AS1后进行高糖处理)、miR-NC组(转染miR-NC后进行高糖处理)、miR-200a组(转染miR-200a mimics后进行高糖处理)、si-DLX6-AS1+miR-NC组(共转染si-DLX6-AS1和miR-NC后进行高糖处理)、si-DLX6-AS1+miR-200a组(共转染si-DLX6-AS1和miR-200a后进行高糖处理)。细胞转染按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书步骤进行，转染48 h后再给予高糖刺激48 h。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡 细胞按照上述分组处理后，消化细胞，采用结合缓冲液调整为单细胞悬液。取100 μl细胞悬液(1×106个/ml)，分别加入10 μl的Annexin V/FITC、5 μl的PI在室温条件下避光孵育15 min。流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.4RT-qPCR检测 利用TRIzol试剂从足细胞中提取总RNA，使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒将RNA逆转为cDNA。以cDNA为模板，利用下述引物、SYBR Green Master Mix在ABI 7900 系统进行实时PCR扩增。用2-ΔΔCt法分析DLX6-AS1、miR-200a、nephrin、desmin、vimentin的表达水平。引物序列：DLX6-AS1正义链：5′-CCAAATGCTACCATCCAGCC-3′;反义链:5′TCTGGCTTCCCTTAACCAAAA-3′；GAPDH正义链:5′-CGACACTTTATCATGGCTA-3′;反义链:5′-TTGTTGCCGATCACTGAAT-3′；miR-200a正义链:5′-CACCGCCTCCCATTGTC-3′;反义链:5′-CACAGGAAGTCAGTTCAGACC-3′；U6正义链:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反义链:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；nephrin正义链:5′-CTCGTGTCTCCCAGCGTAAT-3′;反义链:5′-AACTGTGCTTCCTGCCTCAG-3′；desmin正义链:5′-GTGAAGATGGCCTTGGATGT-3′;反义链:5′-GCTGGTTTCTCGGAAGTTGA-3′；vimentin正义链:5′-GATCAGCTCACCAACGACAA-3′;反义链:5′-GCTTTCGGCTTCCTCTCTCT-3′。

1.5Western印迹检测 使用RIPA裂解缓冲液从足细胞中提取蛋白质，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，并转移到聚偏氟乙烯膜。室温下用5%脱脂牛奶封闭膜2 h；将膜置于一抗溶液(caspase-3、GAPDH均按1∶1 000稀释，)中室温条件下孵育2 h；洗涤后，将膜置于二抗溶液(1∶1 000稀释)中室温条件下孵育2 h；洗涤后，进行增强化学发光试剂显色；以GAPDH为内参，采用Image J软件对目的条带灰度值进行分析。

1.6双荧光素酶报告基因实验 将含有与miR-200a存在结合位点的DLX6-AS1野生型序列或含有miR-200a结合位点的DLX6-AS1突变型序列克隆到荧光素酶报告载体，构建野生型/突变型荧光素酶报告质粒(WT/MUT-DLX6-AS1)，该过程由上海吉玛制药公司完成。利用Lipofectamine 2000转染试剂将WT-DLX6-AS1、MUT-DLX6-AS1分别与miR-200a mimics、miR-NC共转染足细胞，在转染48 h时测定各组细胞荧光素酶活性。同时将si-NC、si-DLX6-AS1分别转染足细胞，在转染48 h时按照1.4步骤检测miR-200a表达水平。每组实验设置3个平行实验，重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t软件检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1DLX6-AS1在高糖诱导的足细胞中的表达 与正常糖组比较，高糖组足细胞desmin和vimentin mRNA表达、细胞凋亡率、DLX6-AS1表达显著升高，nephrin mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表1和图1。

表1 DLX6-AS1在高糖诱导的足细胞中表达

图1 高糖诱导的足细胞凋亡的影响

2.2抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin表达的影响 与si-NC组比较，si-DLX6-AS1组足细胞DLX6-AS1表达、desmin和vimentin mRNA表达、凋亡率、caspase-3蛋白表达显著降低，nephrin mRNA表达显著升高(P<0.05)。见图2、图3、表2。

图2 抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡的影响

图3 caspase-3蛋白表达

表2 抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表达的影响

2.3DLX6-AS1靶向miR-200a 生物信息学软件在线预测显示，DLX6-AS1与miR-200a之间存在部分连续互补的核苷酸序列。见图4。双荧光素酶活性检测显示，miR-200a和WT-DLX6-AS1共转染组足细胞荧光素酶活性较miR-NC和WT-DLX6-AS1共转染组显著降低(0.41±0.05 vs 1.04±0.11；t=15.642，P=0.000)；miR-200a和MUT-DLX6-AS1共转染组足细胞荧光素酶活性较miR-NC和MUT-DLX6-AS1共转染组无显著变化(1.03±0.12 vs 1.05±0.13；t=0.339,P=0.739)。RT-qPCR检测显示，si-DLX6-AS1组足细胞miR-200a表达水平较si-NC组显著升高(3.28±0.35 vs 1.02±0.13；t=18.159,P=0.000)。

图4 DLX6-AS1靶向miR-200a

2.4miR-200a对高糖诱导的足细胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表达的影响 与miR-NC组比较，miR-200a组足细胞miR-200a和nephrin mRNA表达显著升高，desmin和vimentin mRNA表达、凋亡率、caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表3、图5、图6。

表3 miR-200a对高糖诱导的足细胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin mRNA表达的影响

图5 miR-200a对高糖诱导的足细胞凋亡

图6 Western印迹检测caspase-3蛋白表达

2.5miR-200a可增强抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡的影响 与si-DLX6-AS1+miR-NC组比较，si-DLX6-AS1+miR-200a组足细胞miR-200a表达显著增加，凋亡率、caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图7、图8、表4。

图7 miR-200a可增强抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡的影响

1～2：si-DLX6-AS1+miR-NC组，si-DLX6-AS1+miR-200a组

2.6miR-200a可增强抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞中nephrin、desmin、vimentin mRNA表达的影响 与si-DLX6-AS1+miR-NC组比较，si-DLX6-AS1+miR-200a组足细胞nephrin mRNA表达显著升高，desmin和vimentin mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 miR-200a可增强抑制DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡及nephrin、desmin、vimentin表达的影响

3 讨 论

近年来lncRNA在DN中的作用被逐步揭示。研究显示lncRNA肺腺癌转录本(MALAT)1在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾脏中表达上调，抑制MALAT1可减轻高糖诱导的足细胞损伤〔7〕。lncRNA SOX2基因重叠转录本(SOX2OT)通过诱导细胞自噬、提高细胞活力、抑制细胞凋亡可显著高糖诱导的足细胞损伤〔8〕。此外，lncRNA 母系表达基因(MEG)3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路可降低足细胞迁移能力、抑制活性氧生成进而改善DN足细胞损伤〔9〕。DLX6-AS1是一种新型lncRNA，目前对DLX6-AS的研究主要集中在肿瘤方面〔10，11〕，其在DN中作用并未阐明。

本研究首次探讨了DLX6-AS1在DN中对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用。结果显示，高糖诱导后足细胞DLX6-AS1表达显著增加，与史嫣〔5〕研究结果吻合，提示DLX6-AS1异常表达在DN进展中具有重要作用。caspase-3细胞凋亡发生的最终执行因子，进一步功能分析显示，高糖诱导可促进足细胞凋亡，提高caspase-3蛋白表达水平，而抑制DLX6-AS1表达可减轻高糖诱导对足细胞的凋亡促进作用。nephrin是一种重要的狭缝隔膜蛋白，在足细胞中协调细胞连接和细胞骨架动力学的作用，其表达缺失可导致蛋白质滤过能力丧失，进而导致蛋白尿的发生，nephrin表达降低被认为是DN足细胞损伤的重要特征〔12〕。vimentin和desmin为细胞骨架中间丝蛋白，vimentin分布在细胞核、线粒体等细胞器边缘，对于维持细胞骨架和完整性具有重要作用。研究指出，在足细胞损伤时往往伴有vimentin、desmin表达增加，失去上皮细胞特征发生间充质转化〔13,14〕。本研究结果提示，DLX6-AS1异常表达可能是导致DN足细胞凋亡、损伤的重要因素。

研究表明，lncRNA通过靶向miRNA在调控各种生物学过程中发挥重要作用〔15〕。例如，LncRNA核富含丰富的转录本(NEAT)1通过与miR-23c相互作用可促进肾小球系膜细胞增殖、纤维化和上皮间质转化，抑制细胞凋亡〔16〕。lncRNA癌易感性候选基因(CASC)2通过下调miR-133b可降低高糖诱导的系膜细胞氧化应激损伤和细胞外基质积累〔17〕。本研究中miR-200a被选定为DLX6-AS1下游靶基因，并通过双荧光素酶报告实验、RT-qPCR检测进一步证实DLX6-AS1对miR-200a的靶向负调控功能作用。既往研究表明，miR-200a可抑制高糖诱导的足细胞Wnt/β-catenin通路活化，促进nephrin表达从而减轻足细胞损伤〔18〕。miR-200a还可缓解肾间质纤维化〔19〕。此外，有研究指出新型姜黄素同源物C66对小鼠糖尿病肾病的保护作用可能与上调miR-200a表达有关〔20〕。与上述研究一致，本研究发现过表达miR-200a可减轻高糖诱导的足细胞凋亡，降低caspase-3、vimentin、desmin表达，并升高nephrin表达水平。此外，进一步研究显示过表达miR-200a还可增强si-DLX6-AS1对高糖诱导的足细胞凋亡、损伤的保护作用。

综上，高糖诱导的足细胞中DLX6-AS1表达上调，抑制DLX6-AS1通过靶向miR-200a可减轻高糖诱导的足细胞损伤，这为DN的治疗提供了新的思路。