miR-455对Omi/HtrA2介导的人涎腺腺样囊性癌细胞株线粒体凋亡的影响

李立恒 周军 张敏 王芹 安峰 张丽娟 汪佳 张凡

(1河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000；2张家口市第一医院口腔科；3张家口学院临床学院；河北北方学院附属第一医院 4小儿外科；5病理科)

人涎腺腺样囊性癌是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，占涎腺上皮性肿瘤的8%～10%，可发生于任何年龄，易发生于腮腺、颌下腺、舌下腺等，具有神经周围浸润特征，容易侵入神经而发生远处转移〔1～4〕。目前，人涎腺腺样囊性癌的治疗方式主要是手术，但疗效不太理想且复发率及患者不良预后率较高。微小RNA(miRNA)可作为癌基因或抑癌基因发挥功能、调控细胞增殖和凋亡等生物学行为，与肿瘤的发生发展密切相关〔5〕。研究发现，miR-455在胃癌〔6〕、宫颈癌〔7〕、结肠癌〔8〕等肿瘤细胞中异常降低。线粒体促凋亡分子丝氨酸蛋白酶(Omi/HtrA2)是新发现的线粒体促凋亡因子，在调节细胞凋亡中发挥重要作用〔9,10〕。高凤兰等〔11〕研究发现，Omi/HtrA2基因过表达对食管癌细胞有明显抑制作用，且可明显提高癌细胞凋亡率。以往关于miR-455、Omi/HtrA2单独在宫颈癌、胃癌、食管癌等肿瘤中研究较多，而在人涎腺腺样囊性癌中鲜有报道，因此，本研究以人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC-M)为研究对象，分析miR-455对Omi/HtrA2介导的人涎腺腺样囊性癌细胞株线粒体凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 收集2017年8月至2019年3月在河北北方学院附属第一医院70例因原发病手术切除并经病理诊断为人涎腺腺样囊性癌患者的癌组织(其中腮腺39例，颌下腺20例，舌下腺11例)为人涎腺腺样囊性癌组，男33例，女37例，年龄23～75岁，平均年龄(52.19±12.36)岁；选取正常涎腺组织65例(来源于同期医院颌面部骨折手术患者)为对照组，男29例，女36例，年龄25～73岁，平均年龄(50.68±10.59)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P=0.449),具有可比性。无菌操作下取得的新鲜组织放入无菌冻存管后迅速投入液氮中快速冷冻，再转至-80℃冰箱长期保存。人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(ACC-M)购自中国科学院上海生物科学研究所。

1.2主要试剂与仪器 RPMI1640培养基(批号NBG1236)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(批号36G5782)购自美国Gibco公司；链霉素(批号NBG-236)、青霉素(批号FH6-73J)、二甲基亚砜(DMSO，批号17003-032)购自美国sigma公司；蛋白提取试剂盒(批号ME861R)、BCA试剂盒(批号2763DB)、胰蛋白酶(批号BD735N)、琼脂糖、溴化乙锭、LipofectamineTM3000、膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡双染试剂盒(货号HUDY03)均购自上海碧云天公司；羊抗人ki67抗体(批号JD-2847)、Omi/HtrA2(批号YB-S903)抗体、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体(批号XIN-56)、caspase-6抗体(批号XMN-68)、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(批号674GN6)购自美国Proteintech公司；反转录试剂盒(批号7856GU)购自美国Sigma公司)；Trizol Reagent核酸分离试剂(批号83H296)购自日本TaKaRa公司；AceQqPCR SYBR Green Mix(批号NC9343)购自南京vazyme生物公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，批号MC34063)、Al-exa Fluor594(批号ab150169)、Alexa Fluor 488(批号SY0602)购于Invitrogen公司；细胞色素C(批号140670)、线粒体抗体(NM8493)购于英国Abcam公司；CO2培养箱(型号NHD DYE1738)购自日本sanyo公司；倒置荧光显微镜(型号BNJD7836)购自美国Olympus公司；Elx800 酶标仪(型号HSG9832)购自美国Thermo公司)；荧光定量PCR仪(型号HDBC0291)购自Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1细胞复苏 实验室常规消毒，紫外照射30 min，从液氮罐中取出无菌冻存管迅速转到40℃水浴中，轻轻振荡至冻存液完全融化，将细胞悬液移入离心管中，加入含15%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基，离心(3 000 r/min、5 min)，沉淀细胞，调整细胞浓度于培养箱中培养。

1.3.2细胞传代培养 将复苏后的ACC-M细胞株在37℃，5%CO2、饱和湿度为95%的培养箱内培养，培养液为含15%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基，每3 d换液1次，待细胞生长密度达80%时，0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要进行传代培养，收集对数生长期细胞用于后续研究。

1.3.3细胞转染及分组 收集1.3.2中对数生长期的ACC-M细胞接种于6孔细胞板上(5.0×104个/孔)，采用LipofectamineTM3000法进行转染，严格按照试剂盒说明书进行操作。转染后用RPMI1640培养基继续培养24 h。实验分为3组：稀释miR-455 mimics：250 μl无血清培养基RPMI1640稀释10 μl的20 μmol/L的miR-455 mimics、miR-455-NC储存液室温孵育5 min。稀释LipofectamineTM3000：50 μl无血清培养基RPMI1640稀释5 μl LipofectamineTM3000，混匀室温孵育5 min。将LipofectamineTM3000分别与miR-455 mimics(miR-455 mimics组)、miR-455-NC(阴性对照组)混合，静置20 min，加入培养孔，轻轻混匀。以未经处理只加入500 μl RPMI1640培养基的细胞为空白对照组。将培养板置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，转染48 h，收集细胞上清液待测。

1.3.4实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-455水平 取出超低温冰箱内保存的人涎腺腺样囊性癌组织、正常涎腺组织及1.3.3中稳定转染的空白对照组、阴性对照组、miR-455 mimics组细胞采用Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，按照试剂盒说明书进行操作，使用分光光度计测定RNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以RNA为模板，按照试剂盒说明书进行逆转录反应，所得cDNA进行qRT-PCR。反应体系20 μl：2×UltraSYBR mixture 10.0 μl，cDNA模板(25 ng/μl)2.0 μl，上下游引物各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl；反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 20 s，共40个循环。引物由大连宝生生物工程有限公司设计并合成，miR-455以U6作为内参基因。采用2-ΔΔCt方法计算人涎腺腺样囊性癌组织、正常涎腺组织miR-455 mRNA及各组细胞中miR-455 mRNA相对表达量。引物：反向引物5′-3′U6正向引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，反向：5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′；miR-455正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3.5MTT法检测ACC-M细胞增殖能力 取1.3.3各组稳定表达miR-455的ACC-M细胞，将细胞接种于96孔板进行培养，每个孔细胞密度为5×104个，分别培养24、48、72 h后向各孔加入MTT 20 μl，继续培养4 h后，弃去上清，加入150 μl DMSO，振荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解。在酶标仪中570 nm处测定各孔细胞光密度(OD)，重复3次，取平均值。

1.3.6流式细胞仪PI染色法检测miR-455对细胞凋亡的影响 收集1.3.3稳定转染48 h后的各组ACC-M细胞，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒及流式细胞仪检测细胞凋亡情况，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，弃上清，并调节浓度至1×106个/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液加入5 μl的AnnexinV/FITC及10 μl浓度为20 μg/ml的PI混匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。每组均设6个重复。

1.3.7免疫荧光检测细胞色素C释放及光密度情况 将爬片放入24孔板中接种细胞，12 h后转染，用含200 μg/ml氟尿嘧啶(5-Fu)的培养液进行培养，48 h后收集爬片，PBS洗3次(5 min/次)，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗3次(5 min/次)，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Tri-tonX-100)室温通透10 min，PBS洗3次(5 min/次)，胎牛血清封闭30 min，加一抗细胞色素C(鼠抗1∶1 000)、线粒体(兔抗1∶800)室温避光孵育3 h，PBST洗3次(5 min/次)，避光孵育二抗琥珀酰亚胺酯(AlexaFluor594，抗兔1∶1 500)、Alexa Fluor488(抗鼠1∶2 000)30 min，PBST洗3次(5 min/次)，DAPI封片、避光4℃保存，镜下观察并拍照。用Image J软件半定量分析荧光强度。

1.3.8Western印迹检测线粒体凋亡途径相关蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白表达变化 收集1.3.3稳定转染48 h后的ACC-M细胞，PBS洗涤2次后，加入1%Triton裂解液，于冰上裂解30 min，在离心机上15 000 r/min离心20 min，取上清，通过蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，根据BCA蛋白试剂盒测定细胞中总蛋白含量，蛋白样品10～20 μl，经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在加入含5%脱脂奶粉的吐温-20-三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(TBST)溶液室温下封闭1 h后；加入羊抗人ki67抗体(1∶1 000)、Omi/HtrA2抗体(1∶1 000)、caspase3抗体(1∶1 000)、caspase6抗体(1∶1 000)、β-actin作为一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗，加入HRP标记山羊抗兔(1∶5 000)作为二抗，室温下震荡1 h后，用TBST洗1遍，电化学发光(ECL)显色后曝光显影，Tanon 600图像分析系统拍照并进行定量分析。实验重复3次，取平均值，以β-actin为内参分析ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相对表达水平。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1对照组及人涎腺腺样囊性癌组中miR-455表达水平比较 与对照组(1.07±0.20)相比，人涎腺腺样囊性癌组miR-455表达显著降低(0.50±0.11；t=20.299，P=0.000)。

2.2空白对照组、阴性对照组及miR-455 mimics组转染效果检测 miR-455 mimics组ACC-M细胞中miR-455表达水平显著高于空白对照组、阴性对照组(1.42±0.23、0.87±0.19、0.88±0.19，P<0.05)，而空白对照组、阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。

2.3过表达miR-455对ACC-M细胞增殖的影响 CCK-8实验显示，与空白对照组相比，阴性对照组各时间点OD值差异无统计学意义(P>0.05)，miR-455 mimics组转染后48 h、72 h后OD值显著降低(P<0.05)；与阴性对照组相比，miR-455 mimics组转染后48 h、72 h OD值显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组不同时间细胞增殖情况

2.4miR-455过表达对ACC-M细胞凋亡的影响 与空白对照组相比，阴性对照组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，miR-455 mimics组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与阴性对照组相比，miR-455 mimics组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表2、图1。

表2 3组细胞凋亡情况

图1 3组细胞凋亡情况

2.5免疫荧光检测细胞色素C释放情况 荧光免疫结果显示，与空白对照组、阴性对照组比较，miR-455 mimics组细胞色素C呈弥散性分布于细胞质中，围绕在细胞核周围，见图2；细胞色素C、线粒体平均光密度显著升高(P<0.05)，见表3。

图2 荧光免疫检测荧光色素释放情况(×100)

2.6miR-455过表达对增殖蛋白ki67、线粒体凋亡途径相关蛋白Omi/HtrA2、caspase3、caspase6表达的影响 与空白对照组比较，阴性对照组ACC-M细胞中ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白差异无统计学意义(P>0.05)，miR-455 mimics组ACC-M细胞中ki67蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)；与阴性对照组比较，miR-455 mimics组ACC-M细胞中ki67蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表3、图3。

表3 3组细胞色素C、线粒体平均光密度及ki67、Omi/HtrA2、caspase3、caspase6蛋白相对表达量比较

1～3:空白对照组、阴性对照组、miR-455 mimics组

3 讨 论

成熟miRNA是长度为20～23个核苷酸(nt)的单链RNA分子，是基因表达的重要调节剂，通常会降低mRNA稳定性，包括介导肿瘤发生过程基因的mRNA，可作为癌基因或抑癌基因发挥功能、调控细胞增殖和凋亡等生物学行为〔12,13〕。李平等〔14〕研究显示，与慢性宫颈炎组比较，宫颈癌组组织miR-455表达水平显著降低，提示miR-455可能在宫颈癌中发挥抑癌基因作用。本研究结果提示miR-455可能与人涎腺腺样囊性癌的发病有关，其有可能同样在人涎腺腺样囊性癌中发挥抑癌基因作用；提示细胞转染成功，可供后续试验。癌细胞除增殖迅速外，凋亡能力减弱也是癌细胞发展迅速的重要原因。本研究流式细胞仪检测结果提示miR-455过表达可能促进ACC-M细胞凋亡。

线粒体是细胞凋亡调控的活动中心，在凋亡因子的刺激下，线粒体释放出不同促凋亡因子，激活细胞内凋亡蛋白酶〔15〕。Omi/HtrA2是由一种丝氨酸蛋白酶，在内质网合成后由线粒体定向序列/线粒体定位信号(MTS/MLS)引导转运至线粒体，通过自身蛋白酶解或被线粒体加工肽酶降解形成成熟Omi分子〔16，17〕。当细胞受到凋亡刺激反应时，线粒体膜通透性增加，进一步使Omi/HtrA2分子从线粒体释放入细胞质而发挥促凋亡作用〔18〕。caspase3是线粒体凋亡途径关键执行者，当线粒体释放凋亡蛋白(如细胞色素C、Omi/HtrA2)时，引起caspase6活化，进一步发生级联反应，引起caspase3活化，导致DNA断裂发生凋亡〔19〕。本研究免疫荧光检测细胞色素C释放情况，提示miR-455过表达可促进线粒体凋亡，过表达miR-455可能通过激活Omi/HtrA2介导的线粒体凋亡途径促进人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞发生凋亡。

综上，miR-455可能通过Omi/HtrA2介导的线粒体凋亡途径促进人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞发生凋亡。但是本研究未能明确miR-455在人涎腺腺样囊性癌发生发展过程中的具体作用机制，后期仍需进一步研究。