人参皂苷对人宫颈癌细胞相关生物学功能的影响

余瑛 张群贵 崔华子 廖振蓉 王琪 彭涛

(赣州市肿瘤医院，江西 赣州 341000)

宫颈癌病灶发生于子宫颈鳞柱上皮的交界处，该病是当今女性最常患的妇科肿瘤性疾病，也是临床数据统计总结出的危害女性生命安全的前列危险因素〔1〕。临床数据提示：宫颈癌在中国的发病率有逐渐升高的趋势，且伴有大概率的不良预后事件发生〔2～4〕。癌细胞的共同特点在于增殖失控及侵袭迁移能力较机体正常细胞显著增强，而细胞凋亡与其增殖的相互配合关系到机体微环境稳态〔5〕，癌细胞周期不仅影响到癌细胞增殖，对癌细胞凋亡也有重要意义。人参为传统名贵中草药，古来有滋补元气、安神益智及养生之功效〔6～8〕，研究证明人参皂苷Rg3是中药人参中的主要活性成分，且其养生功效与抗肿瘤作用关系密切〔9～11〕。本研究从肿瘤细胞角度分析人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞的杀伤抑制作用。

1 材料与方法

1.1试验材料 人宫颈癌Hela细胞株(武汉博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(澳洲Gibco)、青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)、人参皂苷Rg3(天津阿尔塔科技有限公司)、二甲基亚砜(美国OriGen)、Bio-red550酶标仪、流式细胞仪(上海达迈生物科技有限公司)、Transwell聚碳酸酯微孔膜、苏木精染液(厦门研科生物科技有限公司)、电子显微镜(上海苍茂实业有限公司)等。

1.2细胞培养及药品配制 将宫颈癌Hela细胞培养于室温条件下的基础培养液(含10%胎牛血清、适量青霉素、链霉素)中，培养箱5%的CO2浓度及饱和湿度。人参皂苷Rg3首先进行甘醇溶解，试验时通过基础培养液稀释至甘醇浓度低于0.01%。

1.3噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 对数生长期宫颈癌Hela细胞加入96孔板，试验组分别加入稀释后的人参皂苷Rg3，并使药物终浓度至20、40、50、160、320、400 μg/ml，每组设置平行孔3个，对照组不加药物培养。培养48 h后，各组加入MTT溶液继续培养4 h。结束培养后，移除上清液，每孔分别加入二甲基亚砜(DMSO)震荡至沉淀溶解酶标仪测490 nm处OD值，计算肿瘤细胞生长抑制率，取3次重复试验均值。以抑制率和人参皂苷Rg3浓度做曲线算IC50。生长抑制率(%)=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4流式细胞术分析细胞周期变化 通过MTT法检测出人参皂苷Rg3抑制Hela细胞生长有效浓度，将对应组Hela细胞用浓度为65%的乙醇进行固定并保存。检测前用磷酸盐缓冲液(PBS)进行洗涤，滴入PI染液避光保存30 min于流式细胞仪检测癌细胞的周期变化。

1.5Transwell检测细胞迁移能力 培养48 h后，收集各组肿瘤细胞于无血清培养液多次洗涤计数，每孔110个细胞接种 Transwell聚碳酸酯微孔膜，下室以完全培养基为趋化因子，显微镜观察进入下室的癌细胞数，PBS 洗涤后甲醇溶液进行固定再进行苏木素染色，显微镜下观察，取随机3个视野穿过细胞数的均值评估癌细胞迁移能力。

1.6Boyden 检测细胞侵袭能力 将液态基质胶与无血清培养基混合后加入Transwell聚碳酸酯微孔膜，37℃放置5 h成为固态。各组细胞通过无血清培养液洗涤后以每孔110个细胞接种于固态基质胶上，余下步骤同1.5。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行直线回归及Pearson分析、q检验和χ2检验。

2 结 果

2.1人参皂苷对宫颈癌细胞增殖的影响 试验组宫颈癌细胞增殖抑制率较对照组均显著上升(P<0.05)；试验组宫颈癌细胞的增殖抑制率随人参皂苷Rg3浓度增大而升高，药物浓度与癌细胞增殖抑制率正向相关性(R>0，P<0.05)。见表1。

表1 各组宫颈癌细胞生长抑制情况

2.2人参皂苷对宫颈癌细胞周期的影响 160 μg/ml人参皂苷Rg3组和对照组G0-G1期宫颈癌细胞比例无明显差异(P>0.05)；160 μg/ml人参皂苷Rg3组S期宫颈癌细胞比例较对照组显著上升(P<0.05)；160 μg/ml人参皂苷Rg3组G2/M期宫颈癌细胞比较对照组显著下降(P<0.05)。两组癌细胞凋亡率差异显著(P<0.05)。见表2，图1。

表2 人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞周期的影响

图1 两组宫颈癌细胞周期和凋亡

2.3人参皂苷对宫颈癌细胞迁移能力的影响 对照组癌细胞过膜个数〔(115.33±21.56)个〕较160 μg/ml人参皂苷Rg3组〔(35.23±7.34)个〕显著升高(P<0.05)。见图2。

图2 两组宫颈癌细胞迁移能力(苏木素染色，×200)

2.4人参皂苷对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 对照组宫颈癌细胞穿膜个数〔(90.37±12.59)个〕显著高于160 μg/ml人参皂苷Rg3组〔(29.37±6.45)个；P<0.05〕。见图3。

图3 两组宫颈癌细胞侵袭能力(苏木素染色，×200)

3 讨 论

我国宫颈癌高发年龄为50岁左右〔12〕。就当前情况而言，临床多采用手术及放化疗的治疗手段来应对该类疾病，由于肿瘤疾病的发生发展过程迅速，一旦宫颈癌进入晚期确诊，这对临床治疗方案的制定和实施都是一个挑战〔13〕。因为肿瘤疾病的晚期化疗方案需要加大放射的剂量，这一举措在有效杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常细胞也会带来巨大损害，使患者预后情况不佳〔14～16〕。天然中药材富含的各种有效成分被投入临床的研究和用药，其优势于治疗宫颈癌中日益突出〔17～19〕。人参皂苷作为中药人参的有效成分有缓解机体疲劳、抑制肿瘤疾病及增强人体免疫力的功效，研究表明，人参皂苷Rg3是中药人参中抗肿瘤作用效果较佳的单体成分〔20，21〕。

本试验提示人参皂苷Rg3是通过阻碍宫颈癌细胞的DNA合成使癌细胞滞留在分裂期之前，促进癌细胞凋亡。人参皂苷Rg3能够通过阻碍癌细胞侵袭其他正常体细胞控制宫颈癌疾病。

综上，人参皂苷Rg3能够通过抑制人宫颈癌细胞的增殖，影响肿瘤细胞周期促进细胞凋亡，抑制人宫颈癌细胞的迁移和侵袭等恶性生物学功能来阻止宫颈癌发展。