火焰木花的色素提取条件优化及色素在杨桃果汁中的稳定性

宋宗仁 ,于惠竹 ,王兵丽 ,张国广 ,邹金美*

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000；2.闽台特色园林植物福建省高校重点实验室,福建漳州 363000）

火焰木（Spathodea campanulata）又名火焰树、郁金香树，为紫葳科火焰木属常绿乔木，广泛分布于热带和亚热带地区，原产自非洲，现我国广东、广西、福建和台湾等省都有广泛种植[1].研究表明火焰木的树皮、叶片和花的提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎症等药理作用[2-7]，是一种观赏和食药用兼具的园林植物，但因其是近年来从国外引种而来，国内对该植物的研究还较少，国内的文献多在报道引种栽培的适应性观察和组织培养等方面[1,8-9]，对其有效成分分离和食用药用等研究还较少[10].火焰木花的花色猩红，形同火焰，花形大，花冠外面为红色、内面为黄色，开花时花朵多且密集[1]，花中富含生物碱、皂苷、糖苷类、类黄酮、三萜和单宁等成分[3-5,10-11]，其花提取的色素可以作为染料使用[12]，花的呈色物质主要是花色苷[13].本研究拟探讨火焰木的花中色素的提取条件优化及其在杨桃果汁中的应用，为火焰木花的色素在食用或药用等方面提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火焰木的新鲜花朵，采自闽南师范大学校内火焰木树上.无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、盐酸等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司.新鲜杨桃购自超市.

1.2 仪器设备

本研究用到的实验设备与仪器见表1.

表1 实验所用主要仪器设备Tab.1 Instruments and equipment used in the experiment

1.3 实验方法

1.3.1 火焰木花的色素的最大吸收波长测定

称取5 g 新鲜的火焰木花样品，取30 mL 的体积分数为60%乙醇溶剂，滴加0.1 mol/L 盐酸4 至5 滴，倒入火焰木花瓣，匀浆后在放置于水浴锅中，在55 ℃下浸提90 min后，用离心机在25 ℃、8 000 r/min的条件下离心20 min，取上清液，用60%乙醇将上清液定容到30 mL，用酶标仪在400～800 nm的波长范围内对提取液进行光谱扫描，确定火焰木花色素的最大吸收光的波长.

1.3.2 火焰木花长期保存的护色前处理优化

由于火焰木开花具有季节性，季节性收获的新鲜花朵要处理后能长期保存以方便后续连续的色素提取，为更好的保护花中的色素，进行四种保存方式的比较.1）烘干保存：将鲜花直接放入烘箱内65 ℃进行烘干，待样品烘至彻底干燥后粉碎密封室温保存；2）蒸制后烘干保存：将鲜花放入沸腾水的蒸锅内蒸制3～5 min 后，再放入烘箱65 ℃烘干，待样品烘至彻底干燥后粉碎密封室温保存；3）蒸制后冰冻保存：将鲜花放入沸腾水的蒸锅内水蒸3～5 min后，晾干表面水分后，匀浆放入冰箱冷冻保存；4）鲜冻保存：将采收的鲜花直接匀浆后放入冰箱冷冻保存.

均保存一个月后，称取上述烘干保存的花各1 g，冷冻保存的花各5 g，用60%乙醇作为提取溶剂，分别提取样品的色素，提取方法按照1.3.1进行，然后扫描四种提取物的光谱，光谱和最大吸收峰没有发生变化的保存方法即为合适的火焰木花的保存方法.

1.3.3 火焰木花的色素的提取溶剂筛选

分别称取1 g 蒸制后烘干保存的花的粉碎物18 份，分别取蒸馏水、甲醇、无水乙醇、体积分数为20%、60%的乙醇、乙酸乙酯30 mL 作为提取溶剂对花的色素进行提取，每种溶剂设置3 个平行处理，提取方法同1.3.1，提取结束后用紫外分光光度计在506 nm 处测量各个提取物的吸光值，吸光值最高的即为火焰木花色素的最佳提取溶剂.

1.3.4 料液比对花的色素提取效果的影响

称取1 g 蒸制后并烘干保存的粉碎的火焰木花样品，分别以体积质量比（g∶mL）为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 加入20%乙醇溶剂，再加4 至5 滴0.1 mol/L 盐酸于提取溶剂中，用水浴锅在55 ℃下浸提90 min，用离心机在25 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min，然后取上清液定容至相同体积60 mL，分别用紫外分光光度计在506 nm处测定吸光值，平行试验进行3次.

1.3.5 提取时间对花的色素提取效果的影响

称取1 g 蒸制后并烘干粉碎保存的火焰木花样品，取30 mL 的20%乙醇溶剂进行色素提取，在55 ℃下分别浸提30、60、90、120、150 min 后，用离心机离心取上清液定容至相同体积，用紫外分光光度计在506 nm处测定各处理吸光值，平行试验进行3次.

1.3.6 提取温度对花的色素提取效果的影响

称取1 g 蒸制后并烘干粉碎的火焰木花样品，取30 mL 的20%乙醇溶剂，再加4 至5 滴0.1 mol/L 盐酸于提取溶剂中，用水浴锅分别在25、35、45、55、65 ℃下浸提90 min 后，离心取上清液定容至相同体积30 mL，用紫外分光光度计在506 nm 处测定吸光值，平行试验进行3 次.

1.3.7 火焰木花的色素提取条件的正交实验优化

选取料液比、时间、温度三种因素作为优化条件[12-13].所选因素对火焰木花的色素提取有着不同程度的影响，各因素之间也可能会存在着复杂的相互作用，以提取液的506 nm处吸光值为响应值，结合单因素实验结果，依据正交试验表L9（33）设计了三因素三水平正交试验水平表（表2），优化提取条件.

表2 正交试验因素水平表Tab.2 Orthogonal test factor level table

1.3.8 火焰木花的色素提取优化条件的验证及其花色苷的定量

利用正交试验结果，在优化出的最佳提取条件下对火焰木花的色素进行五次重复提取实验验证.

采用pH示差法[14]对提取物中的花色苷含量进行定量，从提取的花的色素溶液中，吸取2份同体积的样液，用1 mol/L盐酸调节pH分别到pH=1.0和pH=4.5，然后分别用相同pH的水稀释5倍和10倍，在520 nm和700 nm波长下测量其吸光值，代入公式(1)计算其花青素含量.

其中：A=(A520nm-A700nm)pH=1.0-(A520nm-A700nm)pH=4.5；MW 为矢车菊色素3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）的相对分子量（449.2 g/mol）；ε为摩尔消光系数（26 900 L·mol-1·cm-1）；DF 为稀释因子（V/Wt）；L为比色皿的厚度（1 cm）.

1.3.9 火焰木花的色素在鲜榨杨桃汁中的稳定性

购买新鲜杨桃榨汁，取80 mL杨桃汁，分别加入0、5、10、15、20、25 mL的花的色素提取原液，放入三角瓶中混匀并密封，65 ℃巴氏杀菌30 min.将上述样品放置冰箱冷藏保存，连续取样观察14 d，每次测量时从三角瓶中吸取一定量用离心机在25 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液测定506 nm 波长下的吸光值，同时观察果汁的颜色变化.

2 结果与分析

2.1 火焰木花提取的色素的最大吸收波长

火焰木的新鲜花瓣60%的乙醇提取物整体呈现鲜红色，由其光谱（图1）可知火焰木花的色素的最大吸收峰在506 nm 处.因红紫色溶液的最大吸收波长在490～560 nm 之间[15]，火焰木花的提取溶液吸收峰出现的波长和提取液呈现的红色色调一致，选定506 nm 作为后续试验中测定花的色素提取量的波长，以该波长下的吸光值表示所提取的色素的相对含量.

图1 火焰木花提取物的光谱Fig.1 Spectrum of extract of S.campanulata flower

2.2 火焰树花的长期保存前处理优化结果

四种对火焰木的花预处理然后保存的方法中，只有蒸汽蒸后烘干保存或冰冻保存的样品，提取色素后的光谱中能够观察到506 nm 处仍然存在的明显的吸收峰（图2），说明只有蒸汽蒸后烘干或者冰冻保存的样品能很好的保护花中的红色素，直接烘干或直接冰冻保存的样品可能在处理过程中因为花瓣中的酶的作用导致红色素发生结构变化，从而506 nm 处特征吸收峰消失.后续均采用蒸制后烘干保存的花的样品进行试验.

图2 样品不同处理保存方式对提取色素光谱的影响Fig.2 Effect of different treatment and preservation methods on the spectrum of sample extracts

2.3 火焰树花的色素提取溶剂的筛选结果

以蒸馏水、甲醇、无水乙醇、20%乙醇、60%乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂对火焰树花的色素提取完成后，在506 nm 处测定的吸光值（图3）中20%乙醇提取的色素吸光值最高，乙酸乙酯提取的色素吸光值最小，乙酸乙酯溶剂的极性最小提取率最低，可能是火焰木花中的色素主要是水溶性的花色苷构成[13].20%乙醇提取率高、成本低，后续试验采用该溶剂为色素提取溶剂.

图3 火焰木花的色素提取溶剂比较结果Fig.3 Comparative results of pigment extraction solvents of S.campanulata flower

2.4 火焰树花的色素提取单因素实验结果

2.4.1 料液比对花的色素提取效果的影响

随着料液比的增加，吸光值先增大后减小，在料液比为1∶30 时，提取效果较优（图4）.可能是随着料液间溶剂量的增加能够缩短浓度的平衡时间，且可以提高色素分子的扩散速率，使提取溶剂中花色苷等物质增多，从而导致提取量的上升.但料液比达到一定值时，也就是色素分子与提取剂之间达到了溶解平衡后，再增加溶剂的量提取率的增加并不大[16].随着提取溶剂量的增加，会溶解出更多花中的分子，溶解出的某些成分会结合色素使色素的稳定性下降，最终使呈色色素的含量降低[17].

图4 料液比对色素提取效果的影响Fig.4 Effect of material-solvent ratio on pigment extraction

2.4.2 提取时间对花的色素提取效果的影响

提取时间对花色素提取效果的影响见图5，在30～150 min 范围内色素提取效果随着时间的延长呈现先增加后降低的趋势，在90 min 时达到最大.可能是由于浸提时间的增长，使花色素分子分解，从而使吸光值下降.

图5 提取时间对色素提取效果的影响Fig.5 Effect of extracted time on pigment extraction

2.4.3 提取温度对花的色素提取效果的影响

温度对色素提取的影响结果见图6，随着温度的增加花的色素提取效率上升，在55 ℃时达到最大值，随后下降.在低于55 ℃时，随着温度的上升，会加快溶剂分子间的无规则运动，增加生物组织的通透性，所以火焰木花的色素提取效率逐渐增大[18].在高于55 ℃时提取效率下降，可能是因为高温会导致溶剂中的色素分子结构被破坏[16].

图6 提取温度对色素提取效果的影响Fig.6 Effect of extracted temperature on pigment extraction

2.5 正交试验优化结果

由上述单因素试验结果的基础上，选取料液比、时间、温度三个因素，并依据表2 进行了正交试验设计.得到的正交试验结果如表3所示.由正交试验结果的R值可知，对火焰木花的色素提取的影响因素的顺序大小为温度＞料液比＞时间，即温度是影响火焰木花的色素提取的主要因素，时间对花色苷的提取影响较小.由正交实验结果可知，火焰木花的色素的最佳提取条件组合为：A3B2C1，即料液比为1∶40、提取时间为90 min、温度为45 ℃.

表3 火焰木花色素提取工艺的正交试验结果Tab.3 Orthogonal experiment results of a pigment from S.campanulata flower

2.6 正交优化条件的验证及花色苷的浓度测定结果

正交试验结果中吸光值最高的色素提取条件组合在第8 组正交试验中出现，且第8 组的条件与正交实验优化结果一致，即料液比为1∶40、时间为90 min、温度为45 ℃的组合条件.采用该条件进行的5次验证实验，吸光值分别为0.930、0.933、0.935、0.934、0.931，平均值为0.933，与正交优化实验结果一致.

根据pH 示差法，在520、700 nm 波长下测出的吸光值见表4，花色素在不同pH 值下吸光值差别较大，pH值越低吸光值越低，说明火焰木花的花色素主要呈色物质是花色苷[14,17].将数据代入公式(1)计算出2种稀释倍数下提取液中花青素含量分别为41.33、39.58 mg/L，平均值为40.46 mg/L，即吸光值为0.933 的花的提取液中花色苷的浓度为40.46 mg/L.

表4 火焰木花的提取物在两种pH值条件下的吸光值Tab.4 Aabsorption value of pigment of S.campanulata flower at different pH value

2.7 火焰木花提取的色素在杨桃汁中的稳定性

将不同量的火焰木花中提取的色素加入到新鲜的杨桃汁中后，可以明显看到杨桃汁由黄色转变为红黄色，添加花的提取物越多，颜色越鲜艳，呈现红色，果汁的颜色更具有引诱力.14 d 连续的吸光值的测定结果（图7）表明火焰木的花提取的色素在杨桃汁中非常稳定，而且所有添加有色素提取物的杨桃汁在1 d 后的吸光值明显增加，可能是鲜榨杨桃汁的pH 值较低，较低的pH 值对提取物中的花色苷有增色作用[17,20].

图7 火焰木花花色苷在鲜榨杨桃汁中的稳定性Fig.7 Stability of anthocyanin in fresh-pressed carambola juice

3 结论与讨论

以火焰木的花为原料，进行天然花色素的提取，原料来源丰富、廉价，若能开拓出花色素的食药用途，必定可以增加火焰木的产业价值.本研究结果表明火焰木的花经过蒸制后再烘干或冷冻保存能有效长时间保护花中的花色素，可能是蒸汽短时间蒸制后能迅速的灭活花瓣中各种酶类，阻止酶对花色素分子的破坏，短时间的蒸制又不会因温度太高破坏花中的花色素分子，和蒸青绿茶杀青的原理相同[19].火焰木的花色素提取溶液最大吸收波长为506 nm，20%乙醇溶剂提取效果相对最好，最佳提取工艺为料液比为1∶40、时间为90 min、温度为45 ℃的组合条件下提取率最好，此时提取物中的花色苷含量可以达到40.46 mg/L.火焰木花的色素在鲜榨杨桃汁中，在连续14 d 的检测中表现稳定，初步认为火焰木花的花色素可以应用在一些果汁中增色.研究结果为火焰木的花的开发利用提供了基本参考.