HPLC比较去滓再煎法对半夏泻心汤中3种主要成分含量的影响*

姜 侠 闫方杰

(1.滨州医学院中西医结合学院，山东 烟台 264003；2.山东中医药高等专科学校中医系，山东 烟台 264199)

“去滓，再煎取”是《伤寒论》记载的一种特殊煎药方法，后世将其称为“去滓再煎法”。此法在《伤寒论》中有较多运用，但后世医家对此法论述较少且认识不一，其中主要的一种观点认为去滓再煎法是专门针对某些药物而设的，但“某些药物”具体为何药尚未明确[1]。在本课题的前期文献研究中发现，半夏泻心汤是使用去滓再煎法的代表方剂之一，故本实验拟以高效液相色谱法(HPLC)，对比不同煎煮法所得半夏泻心汤水煎液中3种主要指标成分的含量，研究半夏是否是去滓再煎法使用的关键药物。

1 材料与仪器

Agilent 1260 Infinity液相色谱仪，美国Agilent公司；BSA2245-CW型万分之一电子天平，德国Sartorius公司；舒美KQ218超声波仪，江苏省昆山市超声仪器有限公司；小霸王SB-2105G电磁炉，中山市恒顺电器有限公司。

本研究采用的不同煎煮方法所涉及的药材饮片皆购于同仁堂药店(生半夏批号20110101，黄芩批号200701，黄连批号200701，人参批号201001，姜半夏批号210302，大枣批号210302，干姜批号201101，炙甘草批号2102016)，均为达标的中药饮片。

对照品6-姜酚(上海源叶生物科技有限公司，批号B21838)，腺苷(上海源叶生物科技有限公司，批号B21356)，草酸钙(Macklin，批号C11891113)，纯度均≥98%。磷酸(Macklin，批号C10701186)，乙腈(Macklin，批号C12113727)，甲醇(Macklin，批号C12277941)，均为色谱纯；实验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(5 μm,2.5 mm×150 mm)，柱温25℃，进样量20 μL，流动相：乙腈∶水(65∶35)(6-姜酚)、乙腈∶水(10∶90)(腺苷)、0.1%磷酸水溶液(100)(草酸钙)，检测波长282 nm(6-姜酚)、260 nm(腺苷)和210nm(草酸钙)，流速0.5 mL·min-1(6-姜酚、腺苷)、0.3 mL·min-1(草酸钙)。

2.2 供试品及对照品的制备 本实验所涉半夏泻心汤依据人民卫生出版社出版的《伤寒论》149条文所记载的原文使用，半夏(洗，半升)，黄芩(三两)，干姜(三两)，人参(三两)，甘草(三两，炙)，黄连(一两)，大枣(擘，十二枚)。上七味，以水一斗，煮取六升，去滓，再煎取三升，温服一升，日三服[2]，相关的药物剂量及煎药用水量换算参考相关文献[3，4]。

2.2.1 供试品的制备 药物剂量换算后相关剂量为半夏42 g，黄芩(枯芩)47 g，干姜47 g，生晒参(无须)47 g，炙甘草47 g，黄连16 g，大枣30 g。上方准确称定(±0.01g)后倒入5 L的煎药容器中，加水2000 mL，按《医疗机构中药煎药室管理规范》[5]规定将待煎药物浸泡30 min后，倒出浸泡液以便记录饮片的吸水量(至自然滴干为止)，分别标记含湿药材的容器中300、600、1200 mL的刻度。

半夏泻心汤在原著中采用的煎药方法是“去滓，再煎取”，《伤寒论》中常见的煎药方法是煮取后去滓直接温服(如与半夏泻心汤组方非常接近的黄连汤)，而目前中医临床中普遍使用的是煎煮2次混合后分服(《医疗机构中药煎药室管理规范》)的方法，因此本试验将供试品分成了去滓再煎法、汉代常规煎法、现代常规煎法3个不同的煎法组，以达到实验的比较目的。

本实验采用原著的水煎法，以消水体积为煎药依据，本课题组在前期研究[6]中发现，因最终药液的保留体积太少而无法使用煎药机制备供试品，用明火手工煎药又难以把握火候大小，为保证实验条件平行，本次实验采用电磁炉煎药，大火功率为2100 W，小火功率为400 W，以便精准控制保留药液的体积。

去滓再煎法制备(A)：取称定后半夏泻心汤药材配方量，置于5 L的煎药容器中，加水2000 mL，浸泡30 min后，2100 W烧开后调至400 W维持微沸状态，煎至1200 mL刻度处，滤去药渣，将剩余药液400 W煎煮至600(±10)mL，关火。计时共89 min。

汉代常规煎法制备(B)：取称定后半夏泻心汤药材配方量，置于5 L的煎药容器中，加水2000 mL，浸泡30 min后，2100W烧开后调至400W维持微沸状态，煎煮至600 mL刻度处，滤去药渣，收集药液600(±10)mL。计时共87 min。

现代常规煎法制备(C)：取称定后半夏泻心汤药材配方量，置于5 L的煎药容器中，加水1000 mL，浸泡30 min后，2100 W烧开后调至400 W维持微沸状态，煎煮至300 mL刻度处，过滤得药液约300 mL；将药渣再加水1000 mL，2100 W烧开后调至400 W煎煮至300 mL刻度处，过滤得药液300 mL，与头煎药液混合后为600(±10)mL。计时共100 min。

上述药液需用0.45 μm微孔滤膜滤过后，弃初滤液，取续滤液作为供试品溶液A、B、C。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取6-姜酚10 mg，加甲醇，超声溶解，稀释至20 mL，制成500 mg·L-1的6-姜酚对照品溶液；精密称取腺苷10 mg，用5%的甲醇水溶液稀释至20 mL，制成500 mg·L-1的腺苷对照品溶液；精密称取草酸钙20 mg，用0.1mol·L-1的盐酸稀释至40 mL，制成500 mg·L-1的草酸钙对照品溶液。

上述对照品溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液，待用。

2.3 专属性实验 按2.1项下色谱条件测定各空白溶剂的溶剂峰均在5 min之前出峰，结果表明，空白溶剂对本实验无干扰。按2.1项下色谱条件分别取C液及各对照品溶液进行测定，结果显示，各有效成分与相邻峰的分离度均>1.5。见图1。

2.4 线性关系考察 精密量取2.2.2项下3种对照品溶液，分别稀释，按2.1的色谱条件测定稀释后6个梯度浓度下各自峰面积值。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，对照品进样量(X)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。见表1。

表1 3种成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度实验 取2.2.2项下各对照品溶液，按2.1项下色谱条件在3个波长下分别重复进样测定6次，每次20 μL，分别记录6-姜酚、腺苷、草酸钙的峰面积及保留时间，结果峰面积的相对标准偏差(RSD)均<2.0%，保留时间的RSD均<0.5%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 按2.2.1制备6份平行C液，按2.1项下色谱条件分别进样测得6-姜酚、腺苷、草酸钙的平均质量分数分别为52.493 mg·L-1、21.174 mg·L-1、458.726 mg·L-1，RSD均<2.0%，表明本实验方法的重复性良好。

2.7 稳定性实验 按照2.1项下色谱条件分别0、1、2、4、8、12 h进样同一批次C液，测定结果显示6-姜酚、腺苷、草酸钙峰面积及保留时间的RSD均<2.0%，说明供试品溶液在此12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率实验 精密量取4份已知3种成分含量的C液，分别加入一定浓度的标准品，用相应的溶剂稀释后超声混合，按2.1项下色谱条件分别进样，得各成分的平均回收率为94.29%～119.90%，RSD均<1.0%。见表2。

表2 半夏泻心汤中3种成分的加样回收率

2.9 测定结果 分别取A、B、C液，按2.1项下的色谱条件分别重复进样4次，计算6-姜酚、腺苷、草酸钙的平均含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 关于供试品中半夏炮制方法的选择 本实验按照原著，在去滓再煎法、汉代常规煎法中使用生半夏，但目前生半夏在中医临床中较少使用，半夏泻心汤中的生半夏多以姜半夏、清半夏或法半夏代之，考虑到在各种炮制品中姜半夏的止呕作用更符合半夏泻心汤的应用范围，且生姜能够降低半夏毒性，为达到实验目的，本研究在现代常规煎法中使用姜半夏以更加贴近现代中医临床的实际情况。去滓再煎法、汉代常规煎法中使用的生半夏炮制方法参考《金匮玉函经·方药炮制》：“以汤洗十数度，令水清滑尽，洗不熟有毒也”，以1.5 L沸水将生半夏反复冲洗8～10遍，以手触不黏为度[6]。

3.2 结果讨论 由表3可以看出，在本实验条件下，3种成分在去滓再煎法中的含量最高，其中草酸钙的含量比另外2种煎煮法分别提高了20.50%、0.52%，腺苷的含量比另外2种煎煮法分别提高了16.68%、61.23%，6-姜酚的含量比另外2种煎煮法分别提高了56.82%、25.19%。

现代常规煎法原药材中使用的是姜半夏，原料中6-姜酚的含量(来源于辅料生姜)应高于去滓再煎法与汉代常规煎法，但实验结果显示6-姜酚在去滓再煎法中的含量仍然是3种供试品中最高的，说明去滓再煎法对干姜/生姜有效成分的保留效果较好，与前期研究中现代常规煎法的煎药时间最长而6-姜酚在加热后化学结构不稳定的因素有关[5]的观点相一致。

相关文献研究[7]表明，半夏中的刺激性毒性成分主要是由蛋白结合草酸钙形成的特殊晶形的草酸钙针晶，而半夏炮制品(清半夏、法半夏、姜半夏)中草酸钙针晶的含量明显低于生半夏。本实验结果显示，草酸钙在去滓再煎法(使用生半夏)与现代常规煎法(使用姜半夏)中的含量非常接近，说明去滓再煎法确实能降低半夏的毒性成分(草酸钙)。

半夏具有止呕功效，而腺苷是其止呕作用的主要有效成分之一[8]。本实验结果显示，去滓再煎法中腺苷的含量最高，说明去滓再煎法可明显提高药液中半夏的有效成分含量。同时，现代常规煎法(使用姜半夏)中腺苷的含量明显低于另外2种煎法(使用生半夏)，印证了炮制会降低半夏中腺苷的含量[9]的观点。

3.3 有关生姜杀半夏的思考 中药七情配伍“相杀”关系中有“生姜杀半夏”的理论[10]。从理论上推测，6-姜酚(生姜的主要有效成分)的含量越高，草酸钙的含量(半夏的主要毒性成分)应该越低。但在本实验条件下，同样使用生半夏的去滓再煎法和汉代常规煎法比较，去滓再煎法中6-姜酚的含量高于汉代常规煎法，而同时草酸钙的含量没有降低反而高于汉代常规煎法，由此推测“生姜杀半夏”的物质成分未必与6-姜酚和草酸钙有关，本课题组后续将对此问题做进一步的研究。

4 结论

本研究通过对不同煎煮方法制备的半夏泻心汤HPLC进行分析、比较，在本实验条件下能证实去滓再煎法的使用与半夏相关，可以验证“去滓再煎法是专门针对某些药物(比如半夏)而设”[1]的观点。与另外2种古今常规煎法相比，去滓再煎法在明显提高药液中半夏的有效成分含量的同时能降低半夏的毒性成分含量，验证了《伤寒论》中半夏泻心汤采用去滓再煎之法的科学性。