绿藻多糖研究进展

◎ 刘文晶，刘 山，王菲菲

（齐鲁医药学院，山东 淄博 255300）

褐藻、红藻、蓝藻和绿藻是海洋中常见的藻类，许多海藻可以食用，且营养价值高，例如人们常食用的海带属于褐藻类，石花菜、角叉菜属于红藻类，浒苔、石莼属于绿藻类。褐藻、红藻利用率较高，例如卡拉胶褐藻胶等，绿藻研究相对较少。近年来，海边经常发生“绿潮”现象，主要是绿藻门的石莼泛滥，它可作为饲料、食品和药物开发的原料[1]。由于绿藻多糖结构往往比较复杂，大多数为酸性多糖，在结构研究方面研究相对缓慢，但随着检测技术的进步，结构解析方面也有了较大进步，本文就近年来绿藻多糖的研究进展情况进行综述。

1 绿藻多糖提取方法

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是多糖提取最经典的方法，多糖是多羟基化合物，极性较大，所以用极性大的蒸馏水作为溶剂提取绿藻里面的多糖是常用方法。一般先将绿藻冲洗干净，去除杂质，烘干后磨碎得干燥藻粉。将藻粉与蒸馏水按照一定比例混合，用常温或者一定温度蒸馏水进行提取，将多糖溶液浓缩后，用95%的乙醇进行醇沉处理，此方法需计算好料液比、提取时间、提取次数和提取温度等。曹素建等[2]从石莼绿藻类中，按照藻粉与超纯水1∶50的料液比，100 ℃热水提取粗多糖，得率为5.75%。

1.2 酸/碱提取法

酸/碱提取法的基本原理是，弱酸或弱碱溶液可以破坏植物细胞壁，使细胞内多糖成分尽可能多的被提取出来，但要注意的是要选择适合的pH值来进行提取，pH值过大或过小都存在破坏多糖糖苷键的风险。付双超等人[3]确定滇刺枣多糖的最优提取条件为柠檬酸调节pH值到1.5、温度90 ℃、时间80 min，此时多糖提取率为13.62%。王姝垚等[4]采用0.5 mol·L-1NaOH溶液提取肠浒苔绿藻多糖，提取温度为100 ℃，提取时间为2 h，粗多糖得率为6.4%。

1.3 超声波提取法

超声波提取法主要是通过改变超声仪器的功率达到震碎细胞壁的效果，使细胞内多糖溶出，该方法要注意提取时间，防止超声过度，使多糖糖链发生断裂。彭传友等[5]采用超声波提取法提取枇杷叶多糖，结果表明液料比为33 mL·g-1、功率320 W，温度60 ℃、提取时间32 min时为最优提取条件，最优得率为5.78%。此法不用添加额外试剂，相对安全可靠，为枇杷叶多糖的提取提供了最优方案。

1.4 酶解提取法

酶解法提取多糖可以使用一种提取酶，也可以多种提取酶联合使用，原理是用酶破坏植物的细胞壁和细胞膜，使细胞质中的多糖充分溶解出来，提高粗多糖的得率。杜涓等[6]采用纤维素酶提取玉米芯多糖，将玉米芯酶解20 h后，酶解法提取分离后的样品与不加纤维素提取酶的样品对比，发现具有相同的多糖官能团，扫描电镜实验结果显示酶解后的多糖表面变得粗糙，立体结构发生了一定变化。酶解后多糖体外抗氧化活性得到了增强，主要原因是酶解的过程中也破坏了原来多糖的结构，使多糖有一定降解，体外抗氧化活性得到了增强。黄斌[7]在提取海洋绿藻浒苔多糖时，用酶法提取比其他方式多糖得率要高。

2 绿藻多糖分离纯化方法

2.1 除杂

绿藻粗多糖提取之后往往掺杂色素和蛋白质等杂质，首先需要将色素去除，可以采用活性炭吸附法、大孔树脂吸附法等，吸附色素的同时也会损失一部分多糖，也可以使用过氧化氢法等化学方法去除色素，但实验室最简单的方式是采用透析袋透析法。这种方法是将粗多糖用少量蒸馏水溶解，置于透析袋中，外部大量纯水，透析袋内色素会渗透到外部环境中，但由于多糖粒径较大无法透过透析袋薄膜，截留在内部，实现脱色目的，此方法要注意透析袋孔径，防止多糖的外溢。绿藻提取后的多糖有时会携带蛋白质大分子，除蛋白的方式很多，有生物法、物理法和化学法。曹泽虹等[8]采用不同化学方法对骏枣多糖进行脱蛋白处理，发现三氟乙酸法脱蛋白效果最好，样本损失率最小。

2.2 分离纯化

常用的多糖分离方法有多级醇沉法、电泳法等，对于绿藻多糖最常用的是柱层析法。离子交换色谱原理是多糖分子和色谱柱内部填料发生电吸附作用，被离子色谱柱吸附下来，再通过不同浓度的盐溶液作为流动相，使填料与多糖发生解吸附作用，不同浓度的流动相可以使不同类型的多糖分子解离下来，实现分离目的。凝胶柱层析法是运用分子排阻原理实现多糖的分离，填料一般是葡聚糖凝胶、丙烯葡聚糖凝胶，原理是小分子量多糖分子在填料的孔径内游走路径长，流出的时间长，大分子量多糖分子进入填料孔径内受阻力大，不易进入孔径，比较容易流出，流出时间短。HE等[9]采用Q-Sepharose Fast Flow强阴离子色谱柱及Sephacryl S-400凝胶色谱柱对小枝刚毛藻粗多糖进行了分离纯化，得到半乳-阿拉伯聚糖OHSS2，并用高效凝胶渗透色谱法测定其分子量，呈现单一对称单峰，表明多糖纯度较高，分离效果较好。

3 绿藻多样结构研究

绿藻多糖往往是酸性多糖，在解析结构时具有其特殊性，多糖和其他生物大分子类似，具有一级、二级等多级结构，一级结构研究是绿藻多糖研究的基础，随着分析仪器和分析方法的进步，对多糖的结构研究有了进一步进展。高级结构解析包括二级、三级、四级结构研究，主要研究其空间构象。

3.1 一级结构

目前多糖的一级结构解析较为成熟，一级结构解析主要集中在单糖组成、相对分子量、糖残基链接方式、取代基链接位点和单糖的构型等。相对分子量可通过低压凝胶渗透色谱法、高效凝胶渗透色谱法、电泳法和质谱法等进行检测，常采取高效凝胶渗透色谱法测定多糖的分子量，根据液相图谱的出峰时间和不同多糖标准品的分子量做线性回归曲线，根据样品出峰时间即可算出多糖的相对分子量。单糖组成分析常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱法，即把多糖降解后的单糖，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生上发色基团，与标准单糖标准品出峰时间进行对比，确定其单糖组成。甲基化结合气质联用技术是近年来多糖糖残基解析的常用方式，基本原理是多糖的游离羟基被甲基取代，进行酸降解，降解样品经过还原、乙酰化得到甲基化的糖醇乙酸酯，结合气质联用技术分析，与标准数据库进行对比，即可得出糖残基之间的链接方式。值得注意的是，绿藻多糖多为硫酸多糖，还要把脱硫前后的样品进行甲基化对照实验以确定硫酸根的链接位置。LI等[10]从一种礁膜绿藻中用热水提取分离得到粗多糖，进一步通过阴离子交换柱和凝胶排阻色谱柱分离得到纯品多糖PF2，主要的糖残基为→3)-α-L-Rhap-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→,分支部分位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位置上，硫酸根基团位于→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位置上。

3.2 高级结构

多糖作为一种生物大分子，分子量比较大，且海藻多糖往往含有酸性基团，空间结构更为复杂。由于空间结构对生物活性影响较大，所以多糖高级结构解析十分重要，主要包括二级、三级、四级结构研究，研究方法有核磁共振法、X-射线衍射技术、圆二色谱法、糖芯片技术和分子模拟技术等方法。DAYAL等[11]利用X射线衍射技术分析了细菌纤维素结构表征，得到总轮廓、结晶度、晶体尺寸等相关参数。

4 绿藻多糖活性研究

近年来，绿藻多糖的活性一直是多糖研究的热点，包括抗凝血、抗炎、抗肿瘤、调节血糖和免疫调节等活性研究。CAO等[12]从礁膜绿藻中提取出一种多糖，命名为MS-1，经测定，MS-1在体内外均表现出较强的抗凝血活性，并显著降低血小板聚集能力。通过血栓的湿重和长度，以及电诱导颈动脉血栓形成的血栓闭塞时间来评估，MS-1在体外和体内均表现出很强的抗血栓活性。这些结果提示，MS-1可能是一种很有前途的预防和治疗血栓栓塞性疾病的海洋药物。QIN等[13]从绿藻线形硬毛藻中提取得到一种硫酸鼠李多糖，对人胰岛胰样多肽的（Human Islet Amyloid Polypeptide，hIAPP）聚集具有抑制作用，可使hIAPP聚集形态改变，证明该多糖能有效抑制hIAPP聚集，具有较强的抗糖尿病活性。绿藻多糖，不仅可以用于医学研究，在食品、化工方面也有重要应用，比如石莼聚糖可以作为优良的食品添加剂，浒苔多糖可以作为果冻里面的凝胶，绿藻多糖还可以作为有机肥料或者动物饲料。

5 结语

绿藻多糖是一种非常特殊的天然大分子，目前还没有被深度开发利用，目前集中在结构研究和活性研究，在医药、养殖、化工和食品方面有了一定应用。绿藻由于结构复杂，结构解析比较烦琐，尤其是高级结构的解析难度较大，结构与生物活性的构效关系还不够明朗。为更好地研究多糖的结构，可将其进行寡糖制备，通过确定寡糖的结构，进而推断多糖结构。绿藻多糖的活性研究取得了较大进步，但其分子量巨大，分子难以进入细胞内部，因此其作用机制还需要进一步研究。