印记基因与细胞重编程

田佳卉，陈昱光 ，胡建宏 ，雷安民,*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 7121001；2.西北农林科技大学动物医学院)

细胞重新编程是当前生命科学研究中很热门的一个话题。通过人为操作实现的细胞重编程技术手段有两种，一种是体细胞克隆技术，一种是诱导重编程技术。体细胞克隆就是利用单个体细胞的遗传物质置换卵母细胞自身的遗传物质，利用卵母细胞质的重编程能力使体细胞具备发育全能性并最终形成新的个体；诱导重编程技术就是通过母体细胞内转入外源基因(特定的转录因子)，最终形成一个一个小的细胞团，这些细胞团具备囊胚内细胞团(ICM)同等的发育潜能。一般而言，体细胞克隆技术相对于诱导重编程技术而言，其重编程过程更为彻底。

两种重编程的技术手段都涉及到印记基因的一些变化。而印记基因在细胞重编程中的变化规律还不是很清楚，学界还存在较多的争议。本文参阅近年来的相关文献，希望能够将细胞重编程过程中的印记基因的变化进行一些归纳，以达抛砖引玉之意。通过本文的综述希望能够引发更多学者对于重编程过程中印记基因的变化给予更多关注。

1 印记基因的基本概念

基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生的特定修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种特定修饰常为DNA甲基化修饰，同时也包含组蛋白乙酰化、甲基化等其他的表遗传修饰方式。1980年前后，基因印记引起发育学研究人员的广泛重视。Solter和Surani(2010)研究小鼠细胞核移植发现，印记基因影响其发育。同时，McGrath等(1984)进行细胞核移植时发现，两原核分别来自父方和母方是胚胎发育所必需的，如果两原核同时来自父方或者同时来自母方，这种组合胚虽然在初始阶段可以发育，但是后期将发生死亡，无法获得正常个体。这些早期胚胎发育的现象可能是由于印记基因引起，父源或母源印记基因的不表达或过表达都会导致胚胎发育失败。

1960 年，Crouse在研究尖眼蕈蚊( Sciara) 时发现，其2条X染色体中只有来自母系的等位基因具有表达活性，而来自父系的等位基因始终处于沉默状态，进而第一次提出了基因组印记的概念。随后“基因组印记”被用来描述和解释节肢动物物种的性别决定中起作用的父源特定染色体缺失。

印记基因的确切的含义应该是，在有性生殖过程中，为避免和减少发育相关联的关键基因之间的冲突而发生的两性基因间在个体发育中表达并行使功能的分工约定，这种分工是在生物进化的长期过程中形成并固定下来。印记基因在个体的发育过程中存在明确的印记维持、印记擦除和印记重建过程。印记维持在正常体细胞中终生存在，不发生变化，而印记擦除和印记重建过程发生在生殖细胞的增殖与分化阶段。

2 印记基因在胚胎发育过程中的作用

在生殖细胞形成过程中，来自父方和母方的印记将全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子过程产生新的甲基化模式，但在受精时这种甲基化模式还将继续发生改变；母方等位基因甲基化模式在卵子发生过程形成，因此在受精前来自父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式，这就形成了双亲印记基因的不同修饰与表达。一般情况下，印记基因在发挥功能时严格依照印记模式选择性地表达父、母单方来源的拷贝。80%印记基因成簇出现，其表达调控主要通过位于基因簇中的印记基因调控区(ICR)，亦称差异甲基化区域(DMR)来实现。

2.1 印记基因的存在反映了性别的竞争

研究发现，当父方表达的印记基因缺失或被敲除时, 胎儿在子宫内的生长将受到限制; 当母方表达的印记基因,如IGF2R、H19 等，缺失或被敲除，则表现为IGF2 表达过量，导致胎儿生长过大。由此可见，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度，亲代通过印记基因来影响其下一代，使其具有性别行为特异性，以保证本方基因在遗传中的优势。综合上述研究结果表明，印记基因是双亲遗传物质在向后代传递过程中既竞争又妥协的结果。

2.2 印记基因是平衡胎儿和胎盘发育的重要调节因素

研究发现，孤雌胚和核胚发育后缺少胎盘组织,而雄核胚可发育成较好的滋养层细胞,但胚胎本身的发育受阻。由此可知，胎盘的发育需要父方表达的印记基因表达，胎儿的发育则要求母方表达的印记基因表达。同时在反刍动物的胚胎移植后,大胎症的概率增加，这可能与印记基因有关。因此,遗传印记是平衡胎儿和胎盘发育的重要调节因素。但是, 也有一些印记基因与胚胎的发育无关，例如人第 15 条染色体上的三个印记基因,SNRPN、IPW、ZNF127,它们都是只表达父方。这些基因与人类的 Prader-Willi、Beckwith-Wiedemann 和 Angelman 综合征有密切关系。

3 哺乳动物发育中的体细胞循环与生殖细胞循环研究

3.1 生殖细胞与体细胞的关系

1881年，由德国生物学家奥古斯特·魏斯曼提出的“种质论”认为生物体内的细胞分为生殖细胞和体细胞。生殖细胞是遗传信息的载体，寿命是无限的；而体细胞由生殖细胞衍生分化而来，辅助生殖细胞将遗传信息传给下一代，体细胞完成任务后表现为个体的死亡。由生殖细胞结合形成的受精卵分裂发育成为新的生物个体时，总是会“留出”(特殊的细胞分化过程)一些细胞继续作为生殖细胞，同时分化出体细胞辅佐协助生殖细胞把遗传信息传给后代。对人类而言，身体只是生殖细胞的载具，帮助生殖细胞将遗传信息不断地传递下去。

3.2 体细胞循环与生殖细胞循环中印记基因的变化

魏斯曼理论将生命个体分为生殖循环和体细胞循环两个过程。在单细胞生物中，生殖循环和体细胞循环是完全统一的，单细胞生物的分裂既是体细胞循环的结束，也是生殖循环的开始。但在多细胞生物体中，体细胞出现了明确的分工，只有专门负责遗传信息的传代的细胞具有生殖权，最终演化成为高等生命体内的生殖细胞。

生殖细胞的出现是有性生殖的基础，两性配子的结合促进了生物个体之间遗传信息的交流与重组，大大推动和加速了生物进化过程。但是同时也带来了两性遗传信息在后代个体表达中发生冲突的可能性。如孟德尔遗传学中显性性状与隐性性状的问题，实质就是两性遗传信息的竞争性表达。在一些特殊的情况下，尤其是多细胞生物胚胎发育的早期阶段，双亲来源的基因竞争可能会引起基因表达的冲突与异常，导致发育终止。因此两性生殖的过程需要一套有效的机制对特定阶段的特定重要等位基因表达进行分工界定。基因组印记的遗传理论认为母系印记基因促进胎儿和胎盘增长，父系印记基因则限制胎体生长，这种分工需要在配子的形成过程中确定，这可能就是基因印记的最早的进化基础。

哺乳动物发育生物学的相关研究显示，基因印记在精子和卵母细胞发生的早期阶段开始形成，表现为两性生殖细胞之间染色质的不同甲基化(或组蛋白甲基化、乙酰化等其他表遗传修饰形式)范型，在两性配子结合后形成早期胚胎的发育过程中，两性来源的遗传信息都会依照印记基因的分工，协调和高效地进行表达并指导早期胚胎及其后发育。这种印记基因形成的两性基因差异性表达会在个体体细胞的整个生命过程中持续稳定存在，终生不会发生改变，这就是印记基因在体细胞分化过程中的维持；但在新生个体的生殖系统中，当原始生殖细胞进行分化并预备形成配子时，原始生殖细胞就会对双亲来源的印记基因进行全面抹除，并重新依据个体性别重建新的基因印记。

从印记基因的角度出发，新生个体的体细胞循环过程中，体细胞终生携带源自受精卵的基因印记标志；而生殖系统中的生殖细胞其作用就是在个体发育过程中，将双亲来源的印记标记抹除后重建基于自体的印记标记并将其遗传下去。生命个体单次的体细胞循环中，印记基因不发生变化(仅在当前正确的观点)；而在生殖循环过程中，通过生殖细胞形成过程对印记基因的循环性抹除与重建，实现遗传信息在世代之间的传递与更迭。

4 细胞重编程处理研究进展

生命之初，受精卵经过几次有丝分裂后开始分化，由于启动的基因表达谱的差异，不同细胞的发育命运也不尽相同，最终分化为具有不同形态特征和生理功能的终末分化的体细胞和极少数的成体干细胞。所以，个体发育被认为是从全能的受精卵到多能或单能干细胞或不具分化潜能的体细胞的过程，在该过程中细胞逐步丧失增殖和分化能力，并且基本无法逆转。但随着研究的深入，人们发现，卵细胞的细胞质中存在一种“特殊物质”，有能力解除体细胞分化过程中形成的限制，使已经分化的体细胞重新回到早期受精卵或早期胚胎的状态。这说明体细胞的命运是可逆的。成年哺乳动物的体细胞已经积累了相当数量的受损物质，但这些物质并不能阻挡体细胞在卵细胞质内重新获得永生的能力。卵细胞的细胞质中的“特殊物质”类似于具复老还童的“青春因子”，可以让体细胞回到发育的起始点。

4.1 体细胞克隆技术使体细胞重编程

体细胞克隆技术可以使同样遗传背景的个体数量增加，同时能够在不改变个体印记的前提下，使生命返老还童。低等动物通过将个体一分为二完成克隆，如涡虫和蚯蚓，有实验证明涡虫能够被一次性切割279份，其中每份都可以重新形成新的个体；在发育非常早期的阶段，哺乳动物的克隆也可以采用个体一分为二的办法，例如在桑椹胚或者早期囊胚阶段之前对胚胎进行分割，可以得到遗传信息完全一致的两个或者两个以上个体。因此，在发育生物学中应该将细胞分化过程与生殖细胞的特化过程(也是一种特殊的分化)分开，体细胞克隆技术只涉及细胞分化的逆转，并不涉及类似生殖细胞发生过程中的印记基因的重写。

体细胞核移植技术只是动物克隆的方法之一，在低等动物甚至是高等哺乳动物中，都存在着比体细胞核移植技术更为简洁的克隆办法。但是体细胞核移植与这些办法的区别在于体细胞核移植是真正意义上的克隆，即源自单个细胞重新编程的个体，而其他的克隆方法往往是一群细胞共同重编程的结果。

4.2 诱导干细胞技术使体细胞重编程

体细胞在分化过程中，由于周围细胞的竞争以及发育过程的细胞分化压力，朝着预设的、各自不同的方向演化，这样不同的终末体细胞都有着各自独特的基因表达范型，这种范型不但受到细胞内部的严格调控和维持，同时许多外部的细胞所给予的压力也促使细胞稳定停留在这一状态。人工诱导干细胞技术将细胞进行体外培养，使其脱离其在机体内所受到的各种周围管控压力，获得相对独立和自由的生存空间；但同时也失去了很多以前周围细胞的支持，取而代之的是周围细胞提供的许多功能支持必须由自己独立完成。这种外因和内因的简单变化本身就会引发细胞自身基因表达的改变，使得细胞能够适应变化的环境。

人工诱导干细胞技术通过人工强制性地将特定的几个功能强大的多能性因子转入到细胞，这些转录因子能够持续性地引导细胞朝着早期胚胎的表达模式转化，最终这些外源转录因子的持续性表达能够引发细胞内自身基因组中多能性因子的激活，由此这些细胞就不再需要外源的转录因子的存在而仅依赖本身多能性因子的表达就可以维持在类似于早期胚胎的状态。

诱导性多能干细胞最初是日本科学家山中伸弥团队在2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4， Sox2，Klf4 和c-Myc)的组合转入到小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。相比于胚胎干细胞，iPS细胞不会产生伦理问题，且利用宿主自身的成体细胞(如皮肤细胞、血细胞等)经重编程变成iPS细胞，将它们移植回相同个体，就不引发免疫反应，此外iPS细胞非常适合用来构建疾病模型，不过将iPS细胞用于治疗时也有风险，让ips细胞移植到体内时有可能会产生肿瘤。诱导多能新干细胞的获得，不同的动物，其研究进展差异很大。由于猪在人类的器官移植中是一个潜在的异种器官供体动物，所以猪的iPS研究近期一直进展迅速，是当今生命科学的一个研究热点。

4.3 重编程与印记基因

综上所述，理想状态下，重新编程是仅限于体细胞循环过程的发育起点的还原问题，就现在的认知而言不涉及到基因印记的改变。体细胞从早期胚胎向后续的发育过程，是体细胞循环的过程，仅存在着细胞分化，这种分化的基础依赖于生殖细胞结合之前已经产生的印记。体细胞在分化过程中仅存在细胞分化导致的染色质结构的变化，并不涉及到印记基因的问题。而我们现在已有的人工的去分化的手段，第一是核移植技术，其次是人工诱导干细胞技术，都只是将分化的体细胞拉回到原始的胚胎发育起点，但是并不改写或者改变胚胎的印记基因。但在实际情况中，两种重新编程都会经常性地引发印记基因的表达异常，最终引发重编程的失败。

5 目前存在科学问题与展望

5.1 重编程技术在生物医学中的应用

重编程的理论研究具有重要意义。该理论可以应用于再生医学临床治疗，支持我们从患者身上采样，获得体细胞，将这些体细胞进行重新编程使其恢复到发育起始点，然后重新分化成为不同的组织，以此替代患者受损的相应组织，进而达到器官置换(移植替代)的治疗目的。当前，利用干细胞治疗宠物的疾患已经在兽医临床治疗中开展应用。利用干细胞治疗人类疾病的一些领域也已经获得许可。

此外肿瘤生物武学的研究显示，还能多肿瘤发生的原因在于细胞的表遗传，甚至是关键的印记基因发生改变，导致了机体肿瘤的发生，通过对于肿瘤生物学中印记基因表达变化规律的研究，也将有助于医学领域对于肿瘤治疗的进步与疗效改善。

5.2 重编程在家畜育种领域的可能应用与挑战

5.2.1 重编程技术快速复制良种个体 应用体细胞核移植快速地扩增优良个体数量，早有成功报道，大家畜成功比例在1%～3%；人工对于体细胞的诱导重编程也有突破性进展，利用四倍体的补偿技术能够得到来自于诱导重编程细胞的个体。并且这种技术已经用于大量地制作基因缺陷的小鼠模型。然而需要指出的是，体细胞核移植与诱导干细胞的四倍体嵌合法获得个体的机理上是完全不同的。体细胞核移植是单个细胞重新编程后支持的个体发育，而四倍体嵌合的克隆办法则是一群细胞共同重编程的结果。因此从原理而言，四倍体嵌合补偿技术获得的个体要比体细胞克隆技术获得个体的效率高，同时畸形率低。

5.2.2 体外人工生成单倍体生殖细胞 体外人工生成单倍体的生殖细胞是当前十分具有挑战性的工作。科学家已经通过体外培养获得了雌性与雄性的生殖细胞，并且成功得到了后代。这一研究涉及到了印记基因的重写。在活体中，神经系统将自身生活过程中的一些体验融入配子的表遗传修饰中(可以称之为渐进性的进化印记)，参与生殖细胞的形成。而体外人工制作的配子显然缺乏进化印记。通过人工重写印记基因，科学家已经能获得来源于双雌性或者双雄性的后代，尽管效率很低，且双雄性后代并不算完美，但是这些都为我们进一步研究印记基因展现了美好前景。

6 总结

在哺乳动物个体发育过程中，性细胞独立于体细胞而特定的两性性腺环境中发生发展，两性配子生成环境的差异使得两性配子间遗传物质形成差异化的修饰非常简单。而两性间印记基因就是这种差异在分子层面的一个最具代表性的反映。而重编程过程中，体细胞内所携带双亲来源的遗传物质都是在无差异的同一环境下被执行重编程过程，如何能够建立一种重编程的技术手段，使得重编程过程不伤及体细胞本身携带的印记基因，能够对带有不同修饰的双亲遗传组织达到区别对待、精准施作，达到完美的重编程效果是当前急需深入研究的重要课题，需要科技工作者严谨，认真的长期探索。

在重编程的研究领域仍有一些关键的生物学问题值得我们深入思考，例如①不同领域科学家对生命起始点的认识仍不统一。哺乳动物胚胎是卵母细

胞受精形成。受精之后形成含有两个原核的受精卵，称之为原核期胚胎(1984年，诸多孤雌和孤雄胚胎的制备就是利用这一时期的胚胎，也是由此使人们关注到了印记基因问题)。近期的研究发现，即使卵子受精之后，精卵来源的遗传物质仍然未能够完全的融合，甚至到了进入二细胞前的第一次有丝分裂阶段，仍然是相对独立的存在，证据就在于父母双方来源的染色体有各自独立的纺锤体结构；生命起始于精子进入卵子？还是起始于雌雄原核融合？或是起始于胚胎基因的表达；②此外，源自父母双亲的基因印记的最终定型的时间点目前并不确定。研究发现，雌雄原核的甲基化状态是完全不一样的，且卵子内存在一些物质能够对精子核进行不同于卵原核的甲基化修饰，这种甲基化修饰应属于基因印记的一个组成部分。但这些甲基化的修饰在印记基因中的比例尚不清晰。利用受精卵作为细胞质受体核移植研究显示，雌雄原核中只有雄原核才具有类似于成熟卵细胞质的重编程能力。对于印记基因的研究是未来的一个重要研究方向，帮助我们更加深刻理解有性生殖。