亚抑制浓度抗生素对细菌水平基因转移的研究进展

2022-12-06丁曼琳陈文碧张菲阳综述周英顺审校

西南医科大学学报 2022年5期

丁曼琳，陈文碧，张菲阳综述周英顺审校

1.西南医科大学附属中医医院检验科（泸州646000）；2.西南医科大学基础医学院病原教研室（泸州 646000）

近年来，抗生素耐药性在全球范围内构成了严重的公共卫生威胁[1]。编码β-内酰胺酶的抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）如blaKPC、blaCTX和blaOXA等，已在各种环境中检测到，包括河流[2-3]、海水[4]、污水[5-7]、土壤[8-9]、医院环境[10]等，使细菌获得对大多数青霉素类和头孢菌素类抗生素的耐药性，对人类健康危害极大。

1928 年，格里菲斯（Griffith）首次描述了水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）的现象[11]，并发现了细菌获得外源DNA的一种方式。HGT由转化、转导和接合这3 种不同的机制介导。ARGs 的水平转移是加速环境中抗生素耐药性形成和富集的主要原因之一，基因的转移不仅可以发生在同源细菌之间，也可以发生在革兰阳性与革兰阴性细菌之间，甚至发生在不同域之间，导致细菌耐药问题日渐严峻[12-13]。

高浓度的抗生素抑制细菌生长，而亚抑制浓度的抗生素作为细菌通讯和信号的媒介，改变细菌的转录代谢水平。例如，亚抑制浓度可以诱导一系列基因表达谱发生改变，如氧化应激、动力、毒力和生物膜形成能力[14]，在抗生素耐药性和致病性中起着关键作用。目前，有研究报道细菌在亚抑制浓度抗生素下会增加水平基因转移频率，故本文从耐药基因传播的角度出发，阐明亚抑菌浓度抗生素对细菌水平基因转移的影响。

1 亚抑制浓度抗生素定义及来源

抗生素主要用于治疗致病菌，其残留物也可以释放到环境中，例如污水。通常，环境中抗生素的浓度很低，在ng/L 范围内[15-16]，这些低浓度的抗生素并不影响细菌生长，被称为亚抑制浓度（sub-minimum inhibitory concentration，sub-MIC）。

在抗生素的临床应用中，需要结合药物动力学参数给药，并使抗生素浓度大于最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。然而，在实际应用中，感染部位抗生素的浓度往往低于MIC，原因有以下几点：药物动力学因素导致在组织器官中达不到MIC 浓度、药物-药物相互作用[17]、不规范用药[18]、细菌形成生物膜抵御抗生素[19]、病人的某些临床或健康状况可能导致抗生素在体循环中的生物利用度降低，从而可能导致抗生素的亚治疗水平。在畜牧业中，抗生素在动物疾病预防和治疗中起着重要作用，亚抑制浓度的抗生素还被用作生长促进剂（as growth promoters，AGPs），可以促进动物生长。

2 亚抑制浓度抗生素对水平基因转移的影响

目前，国内外也有很多研究表明亚抑制浓度可以促进耐药基因的水平转移。亚抑制浓度的环丙沙星和左氧氟沙星处理供体菌8 h后，均可显著促进大肠杆菌RP4 质粒转入铜绿假单胞菌的接合频率，且呈剂量依赖性[20]。最近的研究表明，0.001 μg/mL的亚浓度四环素（1/150×MIC）处理后，接合转移频率增加了约4倍，说明亚抑制浓度的四环素可以促进抗生素耐药基因的水平转移[21]。鄂顺梅[22]等人发现，大肠杆菌经1/16 ×MIC-1/256×MIC浓度的环丙沙星处理后，与对照组相比，接合频率均升高，其中1/256×MIC 处理组升高1.5倍，接合频率升高趋势与本研究相似：随着亚抑制浓度的降低，接合频率逐渐升高。

目前，在肠道中的HGT 报道较少。肠道是一个复杂的生态系统，宿主提供源源不断的营养物质，维持肠道微生物群的活跃代谢；其种群密度极高[23]，有利于细菌之间密切接触，为HGT创造条件；还有肠道菌群的多样性[24]，这些条件使细菌能够交换遗传物质，包括耐药基因和毒力基因，以适应肠道中的不利条件[25]，所以动物肠道越来越被认为是细菌交换遗传物质的“熔炉”[26]。ZHANG 等报道环丙沙星可以增强志贺毒素的肠内转导[27]。GÖTTIG 等研究了耐药基因blaOXA-48在大蜡螟和小鼠体内的接合转移频率，结果表明，体外接合频率为8.7×10-7，在大蜡螟体内接合频率为1.3×10-4，高出体外接合频率149.425倍，在小鼠肠道内接合频率为2.9 × 10-5，高出体外接合频率33.333 倍[28]。有大量的证据表明，在实验条件下的动物肠道内，抗生素的亚抑制作用可能显著增加水平基因转移的频率[29]。

但是到目前为止，HGT是如何在肠道中发生的，特别是在肠道中影响HGT 效率的体内因素方面，仍有很大程度上的未知。我们对肠道内HGT的了解主要建立在广泛的体外研究上，如果有一种特定抗生素被证明可以极大地提高HGT 在肠道的效率，特别是可以通过不同的HGT通路（接合、转导或转化）传播耐药基因，建议在食用动物中限制该抗生素的使用，可以减少耐药基因传播和多重耐药病原体出现的风险。

3 亚抑制浓度抗生素影响接合转移的机制

3.1 SOS应答

SOS 反应是由lexA 和recA 基因调控的，是一种由DNA 损伤引发的、诱导DNA 修复和突变的应激反应[30]。SOS 反应基因的转录通常受到抑制。在染色体损伤时，暴露的单链DNA 可以吸引RecA 形成核蛋白丝，而核蛋白丝通过促进LexA 阻遏物的分裂激活SOS基因的表达[31]。

目前，已知的几种抗生素（氟喹诺酮类[32]、β-内酰胺类[33-34]和甲氧氨苄嘧啶[35]）可诱发SOS应答并增加细菌的突变频率。此外，ELISA 等发现β-内酰胺抗生素通过激活SOS应答增加金黄色葡萄球菌毒力岛基因的复制和在群体中的传播能力[36]。环丙沙星可导致志贺毒素编码噬菌体诱导并增强大肠杆菌O157：H7的志贺毒素的水平转移[27]。通过接合和基因表达分析，BEABER等证明，使用SOS诱导剂丝裂霉素C和喹诺酮类抗生素环丙沙星诱导SOS 反应，可以显著增强大肠杆菌和霍乱弧菌的ICE转移（300倍）[37]。

3.2 ROS产生

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在许多生理和病理过程中扮演重要角色。近年的研究发现，亚抑制浓度的抗生素介导积累的ROS 可通过诱导MarA和SoxS提高细菌耐药、耐受性的产生[38-39]。HAN[40]等发现亚抑制浓度的季铵盐类化合物增强了细菌的膜通透性，刺激细菌产生ROS，这可能促进了质粒在细菌之间的转移。LU[41]等发现三氯生可以触发ROS从而促进细菌之间的ARGs 接合转移。这些发现提高了我们对抗生素耐药性传播的潜在风险的认识。

3.3 群体感应

群体感应是一种细菌密度依赖性现象，是通过细菌向细胞外环境中产生和释放信号分子（自诱导剂）介导的[42-43]。最近的研究也表明，一些涉及群体感应的微生物衍生因子可以促进HGT。

质粒的接合转移也受群体感应的调控，亚抑制浓度的四环素可以促进RP4 质粒的接合转移，这一过程可以被群体感应激动剂促进，也可被群体感应抑制剂抑制。LU[44]等发现AHLs-SdiA化学信号具有抑制接合转移的作用，群体感应调节基因sdiA的缺失促进了tral基因mRNA的表达。细菌信息素是与群体感应信号通路相关的分泌肽，也通过细胞间信号系统调控接合质粒的转移。由于信息素在肠内肠球菌中普遍存在，群体感应可能在肠道内肠球菌间的HGT 中起重要作用[45]。