乳腺肿瘤细胞体外分离培养方法的研究进展

邱敏，陈柳，代解杰

(1.昆明医科大学，昆明 650500； 2.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，昆明 650118)

近年来，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，乳腺癌即是常见恶性肿瘤之一[1]。乳腺癌是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤，其发病机制复杂，目前尚未完全阐明。培养乳腺肿瘤细胞对于研究各种致病因素导致的乳腺病理改变以及乳腺肿瘤药物研发等均具有重要意义[2-3]。目前研究者已从人、小鼠、大鼠、犬等不同物种中分离出乳腺癌原代细胞，且建立了乳腺癌细胞系，通常从人体中分离的肿瘤细胞较从动物中分离的肿瘤细胞对于个体化的肿瘤治疗更有利，但在筛选白血病药物时，小鼠白血病细胞系是最好的，因此动物肿瘤细胞培养也非常重要[4]。分离培养实体肿瘤细胞是一项挑战，需要专门的技术。乳腺癌原代细胞培养在乳腺癌研究中占据重要地位，但不同物种、个体以及病理类型细胞培养的成功率存在较大差异，因此其广泛应用受到限制；同时，乳腺肿瘤细胞也存在诸多优点，如可为乳腺癌药物的研发和个体化治疗提供理想的实验模型，因此有必要提升其分离培养技术[5]。现就乳腺肿瘤细胞分离培养方法的研究进展予以综述。

1 乳腺肿瘤细胞的常规分离方法

1.1酶消化分离法 酶消化分离法的原理是用特定的酶溶液将组织松散，从而溶解和破坏细胞间蛋白连接，获得细胞悬液。目前应用于酶消化分离法的酶主要包括胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶以及中性蛋白酶等，通常是几种酶按一定比例混合使用[6]。酶消化分离法的优点在于可得到较多的细胞、维持细胞膜完整性、细胞间不粘连，且可正常分裂并进行传代培养，但所得的细胞悬液中混有杂细胞、易污染，且酶消化时间难以控制[7]。研究者可通过差速离心法、有限稀释法以及单克隆挑选等纯化细胞。

胶原酶对肿瘤细胞影响较小，适合消化纤维组织、上皮组织以及肿瘤组织。研究显示，Ⅳ型胶原酶对乳腺癌的消化作用不强，不建议应用；Ⅱ型胶原酶适用于消化乳腺癌中纤维成分较多的硬癌，且易得到乳腺癌单个细胞[8]。钙离子、镁离子以及血清蛋白的存在均会降低胰蛋白酶的活性，因此联合应用胰蛋白酶与乙二胺四乙酸消化分离组织时，在单用胰蛋白酶消化前应避免血清的干扰[9]。胰蛋白酶不适合消化纤维组织成分较多的硬癌，适合消化细胞占比较大的髓样癌[10]。此外，胰蛋白酶还可应用于细胞传代，以消除对肿瘤细胞干扰的成纤维细胞。王立斌等[11]用酶消化分离法分离乳腺癌细胞，在7～10 d时即出现悬浮生长的细胞克隆簇，且该细胞具有持续增殖的特性，最终成功分离出乳腺癌干细胞。史刚[12]用酶消化分离法成功获得乳腺癌原代细胞，该原代细胞于第2天开始贴壁，第4天细胞完全贴壁，几次传代后细胞胞体较大，呈铺路石样外观。

1.2机械分离法 机械分离法是指首先通过物理方法将乳腺肿瘤组织剪切成组织碎块，再用肿瘤组织对应的培养基轻轻冲洗组织碎块，然后通过尼龙或钢网(50～100 μm的开口)过滤、涡旋，并使用移液器(或顺序较小的针)反复抽吸，快速生成单细胞悬浮液，其优点在于可在短时间内得到组织细胞[13]。但利用机械分离法分离肿瘤组织并不是获得肿瘤细胞的合适技术，其物理剪切时间较长，可导致较多细胞死亡，而死亡的细胞又会分泌细胞降解酶，不利于细胞生长，影响细胞存活率[14]。Ljung等[15]利用机械分离法与酶消化分离法分别获得乳腺癌原代细胞，结果发现，与酶消化分离法相比，利用机械分离法分离会产生更多的死细胞和具有超二倍体的细胞。

1.3组织块培养法 组织块培养法是指将乳腺肿瘤组织碎片直接放入培养瓶中恒温培养，其中部分细胞会慢慢从组织中游出并贴壁生长。组织块培养法具有操作步骤简单、培养成功率高、保留了细胞与细胞以及细胞与组织间的良好接触等优点，但细胞长出所需时间较长，且并不是每一个组织碎片均能长出细胞[16]。Hass和Bertram[17]利用组织块培养法培养人乳腺癌活检原代细胞，结果发现，乳腺癌原代细胞群持续生长，其完整的细胞外基质和稳定的细胞表面蛋白表达可以为临床制订新的治疗策略提供一个可重复的筛选平台，以识别新的生物标志物。王敏等[18]利用改良的组织块培养法将装有组织块的培养瓶在孵箱中正置4～6 h，然后再滴入少量培养液，观察组织块的贴壁情况，结果发现，当细胞爬出且铺至瓶底约50%时，用胰蛋白酶消化法纯化细胞获得的细胞活性更好，最终成功在体外分离培养出人乳腺癌原代细胞。

2 乳腺肿瘤细胞的现代培养技术

在研究中使用原代细胞通常会遇到一个问题，即原代细胞只能培养很短的时间，随着代次的增加细胞会停止增殖，且培养的细胞无法保证代次间的遗传信息一致和正常的增殖。因此，在体外无限扩增哺乳动物来源的正常细胞和肿瘤细胞对于个体化医疗和再生医学均非常重要。目前常用的乳腺肿瘤细胞培养技术主要包括3D细胞培养技术和条件性重编程细胞(conditionally reprogrammed cells，CRCs)技术，两者在实用性、功能性方面各具特色。

2.13D细胞培养技术 3D细胞培养技术是指将细胞放置于模仿体肿瘤细胞微环境的3D培养系统内进行体外培养，细胞在3D系统的立体空间结构中生长，构成3D细胞-载体复合物[19]。3D细胞培养技术通过在体外构建类似于体内的细胞生长分化系统模拟肿瘤细胞生长的微环境，且其作为传统2D细胞培养与体内天然环境的桥梁，具有2D细胞培养不可比拟的优势[20]。

成功建立一个3D模型最重要的是选择合适的生物材料，生物材料包括天然聚合物和合成聚合物。天然聚合物主要包括胶原蛋白、明胶、透明质酸、海藻酸、琼脂糖和壳聚糖等，常见的合成聚合物主要包括聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯和聚氨酯等[21]。3D模型包括：①有支架的3D模型，细胞与基质相互作用，可更好地模拟体内肿瘤生长的微环境；②无支架的3D模型，细胞不能附着在培养皿表面，导致细胞聚集形成球状体，其中，无支架的3D模型操作简单、费用低[22]。聚合物支架可以支持肿瘤细胞并允许细胞间营养物质、气体和信号交换，同时还可模拟细胞外基质条件[23-24]。传统基于支架的3D细胞培养只应用单一的生物材料，而近年的研究多集中于支架材料的改造以及混合应用多种材料进行细胞培养[25]。许保海等[26]利用胶原作为3D支架材料建立了一个3D乳腺癌细胞培养体系，该培养体系可有效维持乳腺肿瘤干细胞干性。还有研究表明，可将肿瘤细胞包裹于基质支架形成的小囊中，从而形成大小均一的细胞球，这样可显著增加乳腺肿瘤细胞的活力[22]。彭雪梅等[27]利用人工基质胶构建体外3D细胞培养模型，首先将乳腺癌细胞MDA-MB-231包裹于人工基质胶中，然后再种于底部铺有人工基质胶的培养皿中，结果发现MDA-MB-231细胞形成了一种近似体内的球形结构，且呈现出乳腺癌的去极化特征，成功模拟了乳腺癌在体内的真实形态。

3D生物打印是一项新兴技术，在功能组织和器官的制造方面具有广阔的应用前景。3D生物打印技术是一种通过连续沉积细胞的生物墨水层创建3D结构的生物制造方法[28]。生物打印已成为制造3D人类肿瘤模型的一种有前途的方法，这种模型可更好地再现体内组织结构的关键特征[29]。赵思雨等[30]通过3D生物打印技术构建乳腺癌细胞(MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞)3D水凝胶乳腺癌模型，结果显示在水凝胶支架上培养的 MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞持续增殖并形成多层细胞结构。生物打印技术的优点在于可快速形成所需的肿瘤模型，其缺点在于成本较高和尺寸限制。现有的3D生物打印机体积较大、成本较高，限制了其广泛应用[31]。

微流控技术的目的是通过在一个3D体外系统的芯片上复制血管网络通道和实质模拟体内肿瘤微环境，重建传统细胞培养或动物研究中无法轻易建模的器官的功能单元[32]。微流体通道可定制流速灌注，且常充满水凝胶前体细胞悬浮液，在光照下会凝胶化，可用于血管生成、机械转导途径、肿瘤细胞行为和药物反应研究等[33-34]。Truong等[35]设计了一个3D微流控共培养系统，在芯片上模拟肿瘤微环境的空间组织，对肿瘤-基质相互作用进行力学研究，并分别在3D肿瘤与间质区域共培养乳腺癌细胞和成纤维细胞，结果发现，成纤维细胞可通过诱导乳腺癌细胞中新型基因的表达增强乳腺癌细胞的侵袭能力，从而提高迁移速度，可用于肿瘤分子机制研究。Nagaraju等[36]开发了一种新型3D微流控系统，该系统由同心三层细胞负载水凝胶组成，可同时研究肿瘤-血管串扰对乳腺癌细胞浸润、内渗以及血管成熟的影响。虽然目前微流体研究仍处于起步阶段，但已成为研究乳腺癌的一个重要工具。

总之，肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用可调控细胞分化、增殖和基因表达等过程，体外3D细胞培养技术可更好地了解肿瘤细胞及其分子机制，而3D模型是研究细胞迁移、存活和生长的理想模型[37]。

2.2CRCs技术 CRCs技术是一种将铯源γ射线辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞(Swiss -3T3-J2细胞)与人正常细胞或肿瘤上皮细胞共培养，并添加Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632使正常细胞或肿瘤细胞获得部分干细胞特性和在体外无限复制能力的细胞培养技术[38]。CRCs技术主要实验步骤包括：①J2细胞的辐照，当J2细胞密度达80%时，即可经胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，用铯源辐照器辐射J2细胞，剂量为3 000 rad，也可用丝裂霉素处理J2细胞，确保其不增殖，处理后的J2细胞应立即与分离的原代细胞共培养或收集上清储存；②乳腺肿瘤分离原代细胞，用酶消化分离法分离原代细胞；③共培养，将处理后的J2细胞立即与从组织中分离出的原代细胞在37 ℃、5%的二氧化碳条件下混合培养；④细胞分离，传代过程中，胰蛋白酶消化肿瘤细胞与J2细胞的时间不同，J2细胞优先脱落，从而将肿瘤细胞与J2细胞分离；⑤条件培养基培养肿瘤细胞，在3代共培养后，可采用条件培养基培养法直接培养肿瘤细胞[39]。CRCs技术无需基因修饰即可显著提高细胞的体外增殖能力，并可在短时间内获取大量的原代细胞，且细胞可以无限传代，绕过衰老信号，可广泛应用于新细胞系的建立[40]。但其具体机制目前尚未明确。有研究发现，饲养层细胞可分泌细胞因子，而分泌的细胞因子与抑制剂混合可维持原代组织及相关细胞亚群生长[41]。

通过CRCs技术可成功培养乳腺癌[42]、膀胱癌[43]、前列腺癌[44]、胰腺癌[45]以及肝细胞癌[46]等恶性肿瘤细胞，且这些重编程的永生化细胞无基因操纵和染色体异常。周昕等[47]利用CRCs技术分离培养人原代乳腺癌干细胞，结果显示原代乳腺癌干细胞可稳定传代扩增至第9代，并保持乳腺癌细胞的特征。赵鸿雁等[48]利用CRCs技术成功培养出乳腺癌原代细胞和肺癌原代细胞，通过短串联重复序列分析发现，利用CRCs技术扩增的原代细胞保留了其来源组织的遗传特性。Mahajan等[49]利用CRCs技术从6例乳腺癌患者肿瘤组织中分离培养出乳腺癌细胞，并在传代培养后评估CRCs基因组的变化，结果显示，乳腺癌CRCs保持了其来源的肿瘤组织的总拷贝数、基因突变和微RNA的表达模式。CRCs技术的优点在于可快速、有效地在体外培养原代细胞，且只需微量细胞即可建系，同时还可保持肿瘤细胞的异质性，克服了传统细胞系的缺点，经CRCs培养体系建立的原代细胞可维持组织的染色体特征，并保持正常组织来源的生物学特性[50]。CRCs技术适用于新细胞系建立、肿瘤生物学评估以及抗肿瘤药物的机制与疗效研究、潜在肿瘤治疗靶点的筛选等[51]。

3 乳腺肿瘤细胞培养的意义

肿瘤细胞培养可供体外药敏研究。乳腺肿瘤原代细胞为个体化治疗提供了理想的实验模型，原发性肿瘤细胞可用于基因组测序、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究，而研究数据可用于重新设计新的抗癌策略，对乳腺肿瘤的药物研发具有重要意义。化疗是乳腺癌治疗的重要手段之一，在化疗前通过体外药敏试验筛选出合适的药物、避免药物出现耐药，可提高化疗的疗效[52]。

肿瘤细胞培养可通过建立动物移植模型将乳腺肿瘤细胞移植到同种动物体上，观察肿瘤生长是否与该自发动物成瘤情况相同；也可将细胞移植到裸鼠体内，观察肿瘤的生长情况，如肿瘤细胞成瘤时间和肿瘤大小等。乳腺癌动物模型的制作对乳腺癌的研究具有重要意义，而动物肿瘤细胞的培养也同样重要[53-54]。肿瘤具有异质性和复杂性，因此有必要建立更多的乳腺肿瘤细胞系，以代表原发肿瘤。细胞系是基础研究和临床研究的关键，也是基因和蛋白表达分析、信号转导以及药理和毒理学实验的决定性因素[55]。细胞系是实验室分析的金标准，具有操作简单、自我复制、可用性和同质性的优点[56]。目前关于乳腺癌的研究大多是基于细胞系的研究。

4 小 结

原发性肿瘤细胞系已成为目前乳腺癌个性化治疗不可或缺的工具。肿瘤细胞系的建立需要选择合适的肿瘤细胞分离技术，其中酶消化分离法可得到较多的细胞，且可正常分裂并进行传代，但仍需优化特定组织不同酶的浓度、比例以及消化时间等。CRCs 技术是一种新兴技术，与传统细胞培养方法相比，其可更快速、有效地建立细胞系，且可保留来源肿瘤的遗传特性，有助于从细胞分子角度了解肿瘤的发病机制。而3D细胞培养技术可提供肿瘤细胞生长的微环境，促进细胞间的相互作用，更适用于评估药物反应。总之，利用传统分离培养方法分离乳腺肿瘤细胞并联合目前新技术进行细胞传代可以提高乳腺肿瘤细胞分离培养的成功率。