BRD4功能及其抑制剂研究进展

田杰怡，吴焘

(江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京 210009)

0 引言

关于BRD4的研究源远流长，从最初的只被鉴定为一种细胞周期控制蛋白，而对其是否具有其他功能尚不明确，到如今BRD4的不同亚型被证明在调节与肿瘤发生相关的基因转录中具有相反的活性，这反映出BRD4作为一个药物研究靶点的重要性和其小分子抑制剂开发的可观前景。

1 结构和功能

BRD4即溴结构域蛋白4，和BET家族的其他几位成员一样，具有较为保守的结构：都有两个BRD和一个末端结构域。

其中，BD1和BD2与乙酰化识别有关。两者相互串联，它们不仅与启动子和超增强子区域结合以调节基因表达，而且在几种人类癌症中促进转录。通过抑制BRD4，超增强子区域和癌基因的目标启动子之间的通信通路可以缩短，SEs和目标启动子之间的通信变得快捷，导致癌基因表达的细胞受到特异性抑制，最终导致癌细胞的死亡。

2 BRD4在癌症中的作用及重要性

由于细胞的表观遗传状况因谱系的不同会有很大差异，转录共激活因子如BET在不同种的癌症中也可能会有不同的靶点，这有可能影响BET抑制剂的活性和作用机制。

2.1 肺癌

BRD4作为BET家族中被广泛研究的一员，主要在转录调控中发挥作用。Lockwood及其团队用BET抑制剂JQ1治疗了一组肺腺癌(LAC)细胞株，发现其中一个亚组对BET抑制敏感。与血液瘤相比，JQ1通过一种独立于c-Myc下调的机制抑制LAC细胞。通过基因表达谱的分析，他们发现JQ1以剂量依赖性的方式抑制致癌转录因子FOSL1及其靶基因[1]。而在小细胞肺癌(SCLC)中，Lenhart和伙伴们发现50%的SCLC中存在ASCL1过表达现象，JQ1处理虽对c-Myc蛋白表达没有影响，但会导致转录因子ASCL1的下调。BET溴结构域抑制剂JQ1通过隔离BRD4来阻止其与ASCL1增强子的对接来抑制SCLC，同时，染色质免疫沉淀研究，即COIP实验，也证实了BRD4与ASCL1增强子的结合[2]。其实，也有研究者认为c-Myc是SCLC中JQ1作用的功能靶标，c-Myc在晚期SCLC中的高表达以及预后较差与BRD4相关[3]。

除了JQ1之外，其他的溴结构域抑制剂在肺癌中的功能作用也在被研究，而且令人惊讶的是，BRD4的功能也许不止于目前人们已经有所了解的转录调控、修复一同维持端粒的稳定性等等，还发挥着转录之外的作用。比如，溴结构抑制剂ABBV-075 通过诱导caspase-3/7活性，造成SCLC细胞的凋亡。有研究表明，ABBV-075对促凋亡蛋白BIM的表达有微弱的促进作用，并抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达。此外，BET抑制增加了BCL2-BIM复合物，从而引发细胞凋亡。除此之外，同时使用BET抑制剂和BCL2抑制剂venetoclax (ABT-199)处理细胞的时候，不论体外和体内都可以观察到很强的协同作用[4]。

在肺癌当中，非小细胞肺癌(NSCLC)里目前已经发现致癌驱动突变，这使得分子靶向治疗变得可行。而与之相反但的是，SCLC与目前的靶向致癌突变无关，相反，它主要与TP53和RB1的失活、c-Myc表达的上调、以及异常组蛋白修饰相关。这些发现表明，表观遗传的失调也许在这种癌症的发生发展中发挥着重要作用[5-8]。在过去的30年里，标准化疗联合放疗一直是SCLC的典型治疗选择。SCLC患者一般对初始治疗反应良好，然而大多数患者最终死于复发性疾病。所以，小细胞肺癌(SCLC)迫切需要新的治疗策略，除了单独使用JQ1之外，其联合治疗方案在近几年也收获了许多新思路。比如：在肺癌中(小细胞肺癌与肺腺癌)，JQ1与HDAC6 的抑制剂ACY-1215 的联合治疗可以显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，ACY-1215目前正在多个临床研究中测试用于多发性骨髓瘤和淋巴瘤的治疗，而JQ1由于其毒性，在临床研究中使用受到限制。结合ACY-1215和JQ1可以做到在当前SCLC和既往NSCLC的治疗中使用较低剂量的JQ1。优化剂量的ACY-1215和/或JQ1结合不同的给药方法，很可能可以在毒性降低的情况下获得类似或更好的治疗结果，这些发现可以转化为SCLC患者[9]。溴结构域抑制剂与PD-1抗体可以协同治疗KRAS突变的肺腺癌患者。实际上，KRAS突变在大约30%的人类肺腺癌中存在，尽管近期靶向治疗的进展显示出了很大的希望，但KRAS的有效靶向治疗方案仍未出现[10]。KRAS突变体难愈的原因是免疫抑制机制，如肿瘤中抑制性调节性T细胞的出现增加，肿瘤浸润性T细胞抑制性受体PD-1的表达升高。使用BET抑制剂治疗血液系统恶性肿瘤是有益的，并且它们在非小细胞肺癌(NSCLC)模型中具有treg破坏作用。通过PD-1抗体阻断靶向PD-1抑制信号在肺癌中也有实质性的治疗效果，尽管这些结果局限于少数患者。于是，Adeegbe假设BET溴化域抑制剂JQ1可以与PD-1阻断剂协同作用，促进肺癌的抗肿瘤反应。结果显示，两者联用的确具有协同作用，肿瘤浸润性treg的数量也得到减少。

2.2 乳腺癌

三阴性乳腺癌通常具有较强的侵袭性，Andrieu及其团队报道了一个包括BRD4和Jagged1/Notch1 (配体/受体对)的信号通路，该通路在维持三阴性乳腺癌的迁移和侵袭中发挥重要作用。他们首先通过Transwell实验，分别用(S)或(R)-JQ1预处理人乳腺癌细胞株3小时，然后用系统进行测试。其中，(S)-JQ1是一种广谱的BET -溴化域抑制剂，靶向BRD2, BRD3和BRD4，以非活性对映体(R)-JQ1作为阴性对照。紧接着，他们在对照组和BRD4缺失的乳腺癌细胞株中进行了基因表达分析，并选择了一组涉及迁移和入侵调控的46个基因。他们发现，在MDA-MB-231细胞中，敲除BRD4可导致7个基因表达显著改变，其中下调量最大的基因是JAG1，它编码Notch受体家族的典型配体Jagged1蛋白。进一步的，他们发现BRD4可以调节控制Jagged1蛋白表达以及Notch1的信号转导，但是BRD2和BRD3并不具备这项能力。BRD4能够抑制Notch1的活性，阻碍乳腺癌的侵袭转移。以往研究表明，BET抑制剂会抑制BCL-2或BCL-XL的蛋白表达，而三阴性乳腺癌中BET抑制剂诱导凋亡的关键靶点是MCLL[11]。基于癌症基因组图谱(TCGA)数据集，欧阳和他的团队发现一些自噬相关蛋白，例如AMPK在乳腺癌中显著下调。基于免疫共沉淀实验的结果，BRD4可能与AMPK存在相互作用，进而引起其下调，反之，BRD4抑制剂能够诱导AMPK调节自噬相关的细胞凋亡[12]。

2.3 白血病

在AML细胞中，已经有丰富的研究表明BRD4是其不同亚型的重要治疗靶点。小分子抑制剂，如JQ1和I-BET，可以破坏 BRD4向染色质的招募，导致关键癌基因的下调，特别是细胞-骨髓细胞增生症癌基因c-Myc、BCL2和CDK6。这导致P21肿瘤抑制因子的重新激活，导致许多(但不是全部)血液细胞系和恶性原发细胞的细胞周期停滞和凋亡，特别是那些MLL基因重排的细胞[13-16]。Stewart及其伙伴的研究首次表明JQ1对 (OCI)-AML3细胞系具有活性，该细胞系携带了一些在AML中高度发生的基因突变。据了解，这些基因通常与一些低风险的疾病相关。他们发现，与其他已知的激活P53的化合物联合治疗，即组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，Nutlin-3和罗红霉素，都可以增强JQ1在OCI-AML3细胞的药效，表明JQ1诱导的细胞死亡是通过P53介导的途径，似乎涉及一种caspase 3/7依赖机制。此外，我们发现BRD4与激活的P53相关，这表明JQ1抑制BRD4可能导致染色质招募P53失败，导致DNA损伤无法修复、细胞周期阻滞乃至细胞死亡等等。研究人员发现当用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，NUTLIN-3和化疗药多柔比星和JQ1联用时，后者的药效都得到增强。这些化合物对P53活化的诱导证明了JQ1可使AML细胞对P53介导的细胞凋亡敏感。在进一步的研究中，实验人员们发现BRD4与乙酰化的p53相关，但这种相互作用并不会被JQ1所抑制，这表明二者之间的这种蛋白-蛋白相互作用并不涉及乙酰化赖氨酸与溴结构域相互结合。相反，他们认为在OCI-AML3细胞中，当JQ1激活P53后，可以不依赖于c-Myc阻止BRD4介导的P53被招募到染色质靶点，从而导致细胞周期阻滞和凋亡[17]。根据最近的报道，Huang认为BRD4的激活与NPMc+和AML细胞的自噬存在相关。为了证实这一猜想，该团队对BRD4对自噬过程中几个关键基因的表达的调节作用。已知活性氧的过度生成可激活自噬[18-21]。ROS生成增加可能是由于氧化代谢引起的ROS过度生成和/或Nrf2介导的抗氧化防御能力下降。先前的一项研究表明，BRD4抑制Nrf2介导的抗氧化基因表达，很可能是通过增强Nrf2泛素连接酶Keap1的表达，从而增加ROS水平。本研究中对BRD4在自噬激活过程中，对一系列重要基因包括ATG3、ATG7和CEBPβ的调控作用进行了详细讨论[22][23]。

自BRD4作为表观遗传调控因子被发现以来，关于它的靶基因及相关的信号通路的研究层出不穷。最近的研究提出了一种模型，BRD4作为支架，通过蛋白-蛋白直接相互作用招募多种调节蛋白，如造血转录因子CEBPβ[24]。

通过BRD4- CHIP -Seq对BRD4进行全基因组检测，发现BRD4定位于CEBPβ的启动子和增强子区域，并与其他几个自噬相关基因存在相互作用，表明CEBPβ在自噬中起着不可或缺的作用。进一步研究发现，CEBPβ缺失后Atg3和Atg7表达显著减少。这些数据与Roe等人获得的数据一起表明，BRD4作为上游调控因子，负责将CEBPβ招募到核心基因中，使某些细胞类型实现自噬[25]。另外值得注意的是，Jang的团队发现促生存自噬是AML LSCs对JQ1耐药的机制之一。靶向AMPK/ULK1通路或抑制自噬可能是对抗AML和其他类型癌症对BET抑制剂耐药性的有效治疗策略[26]。

2.4 肝癌

肝细胞癌(HCC)是第五大常见癌症，也是癌症相关人类死亡的第二大原因[27][28]。有研究发现，在HepG2细胞中，JQ1会抑制c-Myc蛋白表达，诱导细胞周期阻滞在G1期，引起P27上调，还能阻止BCL2L11蛋白的表达。引入3‘-UTR突变体BRD4可阻断miR-608诱导的HepG2细胞中的c-Myc下调和增殖抑制[29]。

3 抑制剂种类

表观遗传蛋白一直以来都是药物研究过程中值得关注的重要靶点。迄今为止，关于已有的表观遗传蛋白的研究结果大多聚焦在染色质修饰酶这一部分，即所谓的表观遗传“书写者”和“橡皮擦”。而与组蛋白结合有关的相关蛋白的有效抑制剂一直没有被系统地描述过。

3.1 非选择性抑制剂

JQ1可以说是最早的BRD4小分子抑制剂，它通过竞争性结合乙酰赖氨酸识别基序发挥作用。JQ1和BRD4蛋白之间的这种竞争作用，在依赖BRD4的癌细胞系中可以产生特异性的抗增殖作用。

Filippakopoulos的团队进行了差示扫描荧光法(DSF)实验发现，(+)-JQ1 JQ1的结合是具有一定而选择性的。因为只有BET家族溴结构域的热稳定性得到显著提高，而BET家族以外的溴域没有。与之相比，其异构体与任何溴域都没有明显的相互作用。除此之外，他们还明确了JQ1的结合方式，他与乙酰赖氨酸的结合类似于在乙酰赖氨酸复合物中观察到的相互作用，即三唑环与进化保守的天冬酰胺(BRD4中的Asn140和BRD2中的Asn429)形成氢键[30]。但由于JQ1有很多的副作用以及容易产生耐药性，目前它主要作为化学探针探究BRD4的机制与功能。

近几年，不断有研究团队尝试对它的结构进行优化，或者提出新颖的联合治疗策略来对它的药效进行改善。比如：用氯原子取代苯环对位后，可以同时减小不良反应并提高对BRD4的选择性[31]。另外，如果用一些极性基团取代侧链的取代基替，可以显著增高其活性，如化合物OTX-015，目前已获批进入临床Ⅰ期试验阶段[32]。

而且自最初的报道以来，除JQ1之外，还有报道其他几种具有不同化学型的，但具有类似的结合亲和力、选择性谱和细胞活性的强效选择性BET抑制剂。更重要的是，超过12种溴化域BET抑制剂已经进入临床试验[33-36]。

3.2 双重抑制剂

随着第一个BET溴化域小分子抑制剂JQ1的开发，人们能够证明通过与BRD4结合来取代染色质中的BRD4可以中断该蛋白的生物学功能。最初，Ember和伙伴们在利用BRD4的第一个溴域对激酶抑制剂文库进行共结晶筛选的过程中，识别并表征了14种激酶抑制剂(10种不同的化学支架)作为KAc结合位点的配体。其中，PLK1抑制剂BI2536和JAK2抑制剂TG101209对BRD4表现出最强的抑制潜能，对BET溴化域具有较高的选择性。比较结构分析发现，KAc结合位点的激酶铰链结合支架具有明显不同的结合模式，这也提示了BET蛋白是多种激酶抑制剂的潜在脱靶蛋白。除了KAc识别功能，含BRD的蛋白也被认为是非典型激酶，Ember和伙伴们发现强有力的周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制剂dinaciclib结合到BRDT-1的KAc识别位点，它们与激酶抑制剂相互作用的潜力被发现。通过对BI2536和TG101209与BRD4的不同结合模式的研究，KAc位点为激酶抑制剂的铰链结合组提供了主要的锚点得以确证。这一发现促使他们提出假设，即普通激酶抑制剂(“铰链结合剂”)具有以前未被认识到的潜力作为BET蛋白抑制剂。而以上的这些发现又为合理设计下一代BET选择性和双活性BET激酶抑制剂提供了一个新的结构框架。

随后有研究报道，双PI3K-BRD4抑制剂可以阻断C-MYC癌基因的表达，同时在体内显著抑制肝细胞癌和神经母细胞瘤中的癌细胞生长和转移。这暗示了，也许重要的细胞周期调节剂Polo样激酶1 (Polo-like kinase 1, PLK1) 可以与BET在包括前列腺癌和急性髓细胞白血病在内的多种癌症中产生协同抑制作用，无疑为开发有效抑制BRD4和PLK1的双抑制剂化合物提供了可能性。除此之外，后续发现的多种激酶抑制剂，包括PLK1抑制剂，BI-2536，和JAK2抑制剂，TG101209对BET蛋白家族表现出中等至优异的抑制活性，这些化合物可以等效地靶向激酶和BET蛋白。张炜教授团队通过对小分子化合物BI2536进行结构修饰，得到了能同时有效抑制BRD4/PLK1的双抑制剂化合物UMB160以及能选择性抑制PLK1的化合物UMB131[37-42]。

对所有BRD4配体配合物的分析和与现有激酶抑制剂配合物的比较表明，激酶抑制剂对KAc位点的四种一般结合模式。根据各自铰链结合基团建立的相互作用模式，抑制剂被分为N型，PZA型(如：GW612286X和BI2536)，ZA型(如：化合物SB251527和SB284847B)，Ⅰ型(如：化 合 物SB610251B、SB614067R和SB202190、LY294002)[43][44]。

3.3 选择性BD1/2抑制剂

前文所描述的第一代BET抑制剂做到了特异性抑制BET家族，不作用于其他溴结构域。但是在BET家族内部的特异性无法达到。目前研究已知，有两个可以特异性抑制BD1或BD2的抑制剂，分别是：RVX-208 and ABBV744。

研究表明，处于稳定状态时的基因表达主要需要BD1，而炎症刺激诱导的基因表达需要所有BET蛋白的BD1和BD2的参与。而在很大程度上，BD1抑制剂可以产生的效用和广谱的 BET抑制剂相似，而BD2抑制剂主要在炎症和自身免疫性疾病中扮演重要角色。

研究者们通过热变性评估RVX-208的结合发现，与JQ1一样，RVX-208增加了所有BET 溴结构域的Tm值却没有与其他6个蛋白(CREBBP、p300等)的溴域结合，这表明RVX-208的结合对BET蛋白的溴域具有选择性。

ABBV-744，这是一种具有类药物特性的BET家族蛋白BD2结构域的强效选择性抑制剂。ABBV-744有效抑制了BET家族蛋白的BD2结构域，与BRD2、BRD3和BRD4的BD1结构域相比，ABBV-744的选择性超过290倍，与BRDt的BD1结构域相比，ABBV-744的选择性超过95倍。

4 总结

BET抑制剂开启了癌症治疗中表观遗传药物的新时代。随着时间推移，来自BET抑制剂I/II期研究的临床数据积累得也越发丰富。虽然BET抑制剂在表现出强有力的抗肿瘤活性，但其毒性应谨慎管理。而耐药性和毒性的存在也表明需要开发耐受良好的BET抑制剂，并在不超过毒性阈值的情况下最大化临床疗效。

除了已经描述的BET抑制剂，当前的技术进步导致了替代BET抑制剂分子的发展。含有JQ1抑制剂和聚合物化合物作为载体的纳米颗粒具有更高的等离子体稳定性，克服了JQ1半衰期短的局限性。这些装载jq1的纳米颗粒在体外和体内均对TNBC具有活性。新技术导致BET-PROTACS的发展，这是一种针对结合BRD4并导致其蛋白酶体降解的嵌合分子的蛋白水解技术[45]。

总的来说，对BET抑制的广泛关注导致了通过间接途径产生BET蛋白抑制的非常规药物的开发。