铁死亡纳米制剂在肿瘤治疗应用中的研究进展

季鹏，张雅洁，潘浩，葛凯悦，曹高洁，朱兴宇，吴正红

（1.泰州学院医药与化学化工学院，江苏 泰州225300；2.中国药科大学药学院，江苏 南京211198）

通过动物和细胞水平的研究，目前已经发现细胞存在多种死亡方式，如细胞凋亡、细胞焦亡、铁死亡等。细胞凋亡通过杀死肿瘤细胞抑制癌症发生，化疗即利用细胞凋亡与癌症之间的关系破坏肿瘤，并将其标记为死亡。细胞焦亡是由半胱天冬氨酸蛋白酶家族蛋白介导的细胞死亡。炎性体在细胞焦亡中起调控作用。焦亡使肿瘤细胞生长减慢，现已发现其与胃癌、结直肠癌、乳腺癌、皮肤癌、恶性间质瘤等关系密切[1]。这2种细胞死亡方式是通过直接或间接促进细胞死亡而有效杀死癌细胞[2]。但久之，癌细胞会通过丧失凋亡机制或变异增强抗凋亡信号来减轻损伤，从而产生耐药性[3]。近年来，通过激发人体的免疫系统，增强肿瘤微环境下抗肿瘤免疫力，以发挥抗肿瘤作用的免疫疗法成为一种具有良好应用前景的治疗方式，但其会造成自身免疫过激，引起潜在的毒性以及肿瘤免疫逃逸。因此，探索新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。

2012年Dixon等[4]首次发现并报道了一种新型细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）。不同于传统意义的细胞凋亡和坏死，铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化物过量累积导致氧化还原失衡引起的细胞死亡方式。铁死亡可通过促进芬顿反应、谷氨酰胺分解代谢、多不饱和脂肪酸代谢等方式调节细胞死亡[5]。此外，纳米技术的快速发展也为铁死亡药物提供了新的应用前景。纳米制剂可显著提高难溶性药物的溶解度和生物利用度，使药物在稳定剂作用下分散于介质（通常为水）中，再利用高压均质或控制析晶等纳米化技术形成药物纳米胶体分散体系。纳米制剂具有载药量高，比表面积大，与生物膜黏附时间长以及易于产业化等特点，可以提高其口服生物利用度，改善体内分布。随着铁死亡机制和纳米技术研究的深入，研究者发现纳米载体负载铁死亡诱导剂可有效抑制癌细胞分化、迁移以及减少耐药性，这为乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、鼻咽癌等癌症治疗提供了新思路[6]。

虽然当前基于铁死亡的纳米制剂研究发展迅速，并取得了一定成果，如索拉非尼（sorafenib，SRF）、顺铂以及多药联合治疗等，但是也存在诸多问题，如缺乏靶向性，尺寸小易进入血脑屏障造成潜在毒性，药物载药量小，生物利用度低等。本文综述了铁死亡及纳米药物最新研究进展，以期为安全高效的铁死亡药物研发提供借鉴。

1 铁死亡的概念

2001—2003年，斯托克韦尔实验室完成的一项化合物筛选实验筛选出可以设计杀死肿瘤细胞（携带RAS突变体）而不会杀死其同源亲本的前体。通过这一实验，对铁死亡的相关研究开始得到发展。铁死亡经典激动剂伊拉斯汀（Erastin）、RSL3和能够致使RAS突变的BeJLR细胞也在2003和2008年被陆续发现。但直到2012年，人们才正式用“铁死亡”一词来描述这种由伊拉斯汀诱导的铁依赖、非凋亡形式的细胞死亡。Wan等[7]在对铁死亡进行深入研究后，总结了铁死亡的3项特征，即谷胱甘肽过氧化物酶-4（glutathione peroxidase 4，GPX4）修复脂质过氧化物能力的丧失、氧化还原活性铁的累积和含多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）磷脂的氧化。其中的第3项特征是铁死亡的主要驱动因素。因此，调节第3项特征过程的分子可能诱导或抑制铁死亡。

除了这些特征分子外，铁死亡还表现出区别于其他类型细胞死亡的形态特征：在凋亡中不诱导染色质凝集或凋亡小体形成；在坏死性铁死亡中不发生质膜破裂；在自噬中不引起双膜自溶体形成；在焦性铁死亡中不引起质膜破裂或导致线粒体收缩和线粒体膜密度增加等[8]。铁死亡除了具有特殊的形态特征外，还具有铁积累、脂质过氧化等独特的生化特征。

基于对铁死亡的研究，相关文献报道了铁死亡涉及多种病理过程，如肝脏、心脏和肾脏的缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病[9-10]。目前已经在多种不同类型肿瘤患者中观察到了铁死亡现象，包括乳腺癌[11]、胃癌[12]、肺癌[13]和胰腺癌[14]等。这为恶性肿瘤的治疗提供了一种新方法。

2 铁死亡与癌症的关系

目前，一些化疗药物在临床癌症治疗中取得了成功。但由于癌细胞遗传物质变化，对现有化疗药物的耐药性逐渐增强，这对于癌症的治疗仍是严峻挑战。研究发现，许多耐药肿瘤细胞通过维持间叶细胞状态来减少化疗药物的损伤，但是铁死亡诱导剂可以通过诱导耐药肿瘤细胞绕过细胞凋亡通路，直接发生铁死亡。这是铁死亡诱导剂在治疗癌症方面相比其他化疗药物的一大优势。大量研究证实，铁死亡在杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长中起着关键作用，如铁死亡是非小细胞肺癌[15]、乳腺癌[11]、白血病[16]、胰腺癌[17]等多种肿瘤细胞的致死原因。因此，铁死亡诱导可能是一种新的癌症治疗策略。

目前，美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）已经批准了一些铁死亡药物，如SRF、磺胺法拉嗪和纳米氧化铁用于临床治疗，但像SRF这类可以在多种癌症中诱导铁死亡的临床药物相对较少[18]。此外，体内HT-1080细胞的异种移植模型中发现铁死亡诱导剂（伊拉斯汀、哌嗪伊拉斯素和RSL3）也可以抑制肿瘤生长。总之，在临床癌症治疗中，寻找更多可以诱导肿瘤细胞铁死亡的高效药物，特别是诱导耐药肿瘤细胞铁死亡药物已经迫在眉睫。

3 铁死亡在肿瘤细胞中的作用机制

3.1 促进芬顿反应

芬顿反应（Fenton reaction）的实质是二价铁离子（Fe2+）催化过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2），产生有毒的羟基自由基（· OH），从而引发细胞脂质过氧化。虽然这种铁依赖性的细胞内化学反应可以有效抑制肿瘤细胞的生长，但是肿瘤细胞内的过氧化氢、铁离子浓度普遍较低，无法发挥显著的铁死亡诱导作用。因此，有研究者根据这一不足制备出芬顿反应激活剂，可以在肿瘤细胞内引发高效的芬顿反应。Zheng等[19]将p53（抑癌因子）嵌入到金属框架中，这不仅可以引发芬顿反应，促进细胞内氧化反应，也可以介导旁观者效应，引起周围癌细胞发生高效铁死亡。

3.2 抑制肿瘤细胞中的Xc-系统/谷胱甘肽过氧化物酶-4

Xc-系统是一种由胱氨酸-谷氨酸构成的反向转运蛋白，由轻链亚基（SLC3A2）和重链亚基（SLC7A11）组成。它可以调节细胞内外L-胱氨酸和细胞内L-谷氨酸在细胞膜处的交换，生成谷胱甘肽[20]。谷胱甘肽对于保护细胞免受氧化应激损伤起着重要作用。有研究发现，铁死亡诱导剂伊拉斯汀可以通过抑制Xc-系统直接抑制细胞内谷胱甘肽的合成，降低GPX4反应物浓度，以此促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，最终诱导铁死亡。除了通过抑制Xc-系统来间接抑制GPX4活性外，还可以采用直接抑制GPX4活性的方式。现有的失活GPX4的方法主要包括向肿瘤靶向递送GPX4的小分子抑制剂和具有GPX4抑制功能的纳米载体。Feng等[21]将SRF包裹于纳米载体中，再将Fe3+和单宁酸分别配位到载SRF的纳米载体表面，制备出SFT-MB纳米粒。在肿瘤酸性环境中响应并释放出Fe3+，进而被单宁酸还原成Fe2+，从而维持铁离子不断向亚铁离子转变的氧化还原过程，可保证Fe2+的持续性供应，并协同SRF促进芬顿反应。

3.3 调节肿瘤细胞脂质过氧化水平

脂质过氧化是铁死亡发生的关键，主要来源于膜磷脂中受氧化刺激的PUFA[22-23]。通过将PUFA氧化，可形成脂质过氧化物。在ROS的作用下，脂质过氧化物可形成脂质自由基，对细胞产生毒性，引起细胞损伤。而且，这些自由基可以转移PUFA中的质子，引发新一轮的脂质氧化，进一步传递氧化损伤。此外，脂质ROS水平还可通过亲脂氧化剂进行提高。如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶能够刺激Erastin以加速细胞内ROS的积累，诱导细胞铁死亡。此外，除了诱导芬顿反应和抑制GPX4外，通过在癌细胞内外源递送PUFA加速脂质过氧化物也是增强铁死亡作用以治疗癌症的有效策略[24]。

4 铁死亡纳米技术在癌症治疗中的应用

研究发现，通过纳米载体负载铁死亡诱导剂可以有效降低递药系统毒性，克服肿瘤细胞的耐药性，并显著提高针对肿瘤细胞的铁死亡作用[25]。新兴的纳米医学疗法即基于促进肿瘤细胞内ROS的过量积累和脂质过氧化，主要包括：1）触发或促进肿瘤细胞内的芬顿反应[26-27]；2）抑制GPX4在肿瘤细胞中的表达[21,28]；3）肿瘤细胞脂质过氧化的外源性调节[29-30]。这些方法主要涵盖了触发铁死亡的2个关键因素：细胞内ROS水平和脂质过氧化。随着纳米医学的迅速发展，多样化的多功能性纳米材料能够发挥生成H2O2，清除谷胱甘肽，以及提供芬顿反应催化剂等功能[31]。此外，一些含铁元素纳米材料本身也可诱导铁死亡，从而协同药物实现对肿瘤细胞的增效杀伤。这类能诱导铁死亡的纳米材料制成的药物被称为铁死亡纳米制剂。Gao等[32]根据肿瘤微环境具有弱酸性、低氧和高浓度的谷胱甘肽等生理特性设计出肿瘤微环境刺激响应型的Fe3O4纳米粒。该纳米粒到达肿瘤部位后，在谷胱甘肽的作用下，Fe3+会被还原成Fe2+，并与H2O2生成· OH，提高肿瘤细胞内ROS的水平，从而诱发铁死亡。如今，多种治疗方法的联合对于癌症具有更强的治疗效果，如光热疗法、饥饿疗法、免疫疗法与铁死亡疗法的结合[33-34]。根据不同肿瘤铁死亡发生的特点，对可用于铁死亡治疗的纳米制剂以及与传统疗法的联合治疗研究进展进行综述。

4.1 乳腺癌治疗

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的一种恶性肿瘤，是威胁女性健康的恶疾。目前，已有相关文献报道铁死亡纳米制剂与传统疗法的联合治疗对乳腺癌细胞有着较为理想的抑制增殖效果。Zhu等[35]将一种化疗激素药物康普立停A4（Azo-CA4）装载入上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）中。在异种移植乳腺癌的小鼠模型评价中发现，近红外光辐射下的Azo-CA4会发生异构化，从而引起UCNPs微管破裂，释放出Azo-CA4，导致癌细胞生长周期出现阻滞。另外，将近红外光转换成紫外光的同时，UCNPs又可诱导Fe3+还原为Fe2+，从而促进了脂质的过氧化反应，诱导癌细胞铁死亡。该研究证实了光热疗法与铁死亡纳米制剂联合治疗对乳腺癌的治疗效果较好。该制剂的突出之处在于巧妙利用近红外光和紫外光的转换，分别使药物Azo-CA4和UCNPs各自发挥药效，并实现协同抗癌作用。由于铁死亡抗肿瘤机制的特性，近红外光照射下Azo-CA4纳米载体可以延长动物的生存时间。同样，凋亡分析显示装载Azo-CA4的纳米载体在诱导凋亡细胞死亡方面具有更强的能力。由于Azo-CA4在控制微管动力学中具有构象依赖的活性，因此这种设计可以使药物集中作用于肿瘤部位，而不会对健康器官产生严重的副作用。

除了光热疗法与铁死亡纳米制剂协同作用外，免疫疗法与铁死亡纳米制剂的联合作用也能对乳腺癌发挥理想的治疗效果。Zhang等[36]构建了一种仿生的Fe3O4磁小体（Pa-M/Ti-NC），采用白细胞膜包裹Fe3O4磁性纳米粒，并将TGF-β抑制剂（TGF-β inhibitor，Ti）载在膜内，PD-1抗体（PD-1 antibody，Pa）锚定在纳米粒的外表面。静脉注射给药后，Fe3O4磁性纳米粒可实现磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）诊断与纳米药物示踪。在肿瘤部位，Ti和Pa可以协同产生免疫原性微环境，由此提高癌细胞内H2O2水平；并且Fe3+被还原成Fe2+。在Fe2+的催化作用下，H2O2可产生毒性· OH并导致肿瘤细胞铁死亡。而肿瘤抗原的暴露又可提高微环境的免疫原性。该制剂创新性设计基于营造免疫原性微环境来提高胞内H2O2水平，进而通过还原反应得到大量Fe2+，促进肿瘤细胞的铁死亡，最终实现铁死亡与免疫调节相互促进，达到了理想的联合抗肿瘤效果。该研究结果中不难发现，铁死亡与免疫调节相互促进使得工程磁小体治疗效果明显，且很少出现异常。这表明工程磁小体可以作为一个具有较高安全性和性能的抗癌治疗方式。

4.2 肝癌治疗

肝癌是发病率排名第六的恶性肿瘤，也是全球第四大肿瘤相关死亡原因。目前，SRF是临床上针对肝癌治疗常用的有效药物。然而，单纯使用SRF治疗肝癌效果有限。为此，Feng等[21]将Fe3+和单宁酸配位到载SRF的纳米载体表面，制备了SFTMB纳米粒并对其进行评价。结果显示该制剂能充分利用肝癌中的酸性微环境。通过携带还原剂单宁酸以及外源性的Fe3+，既通过还原反应获得Fe2+，进而使H2O2反应生成· OH杀伤肿瘤细胞，又释放SRF诱导其发生铁死亡，并通过单宁酸将芬顿反应的产物之一Fe3+源源不断地还原成Fe2+，实现了循环性的诱导肝癌细胞发生铁死亡，极大地提高了治疗癌症的效果。这种多功能纳米粒SFT-MB的设计以干预肿瘤铁代谢增强铁死亡，而达到强烈抑制肿瘤增殖的目的。与SRF给药组相比，SFT-MB在处理细胞后，大量细胞失去了细胞的完整性，这表明纳米粒SFT-MB有着更强的肿瘤抑制效果。

除直接供应外源铁离子加速芬顿反应的铁基纳米材料外，还有一系列不含铁的纳米材料通过利用内源性铁来诱导肝癌细胞死亡。Wang等[30]报道了一种通过“一锅法”合成的精氨酸修饰的锰掺杂硅纳米粒（arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs）。研究者将阿霉素（adriamycin，DOX）载入AMSNs并注入人肝癌细胞Huh7肿瘤异种移植裸鼠体内评价药效，发现AMSNs/DOX组相比AMSNs组以及游离DOX组而言，对肿瘤的抑制率最高。由此证明，它能使GPX4失活进而诱导细胞发生铁死亡。与传统纳米颗粒相比，以精氨酸为基础建立的超薄表面覆盖层和纳米气泡结构显著提高了AMSNs的谷胱甘肽耗尽效率，从而使GPX4高效灭活肿瘤细胞。该研究结果显示，不同于以往报道的锰基纳米材料在肿瘤治疗中只提供了消耗GSH的辅助功能这一说法，合理设计的AMSNs可直接在体内外诱导铁死亡，获得高效的肿瘤靶向治疗。

4.3 肺癌治疗

原发性支气管肺癌简称肺癌，主要起源于气管、支气管和肺的恶性肿瘤。它是当今世界上发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。生物体内存在一种内源性氧化还原酶——葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）。它可以专一且高效地催化β-D-葡萄糖形成葡萄糖酸和H2O2，H2O2又会和Fe2+反应诱导肿瘤细胞铁死亡。肿瘤的生长需要葡萄糖供应ATP以获得能量，而GOD可以消耗肿瘤中大量的葡萄糖切断肿瘤营养物质供应，阻碍肿瘤血管生长，因此被称为肿瘤的“饥饿疗法”。研究发现，联合铁死亡和“饥饿疗法”为肺癌的治疗提供了一条新思路。Li等[37]报道了一种负载GOD的纳米聚合物胶束（theraNR），在肿瘤酸性微环境下能特异性增加胶束的通透性，从而使theraNR能到达肿瘤部位，释放出GOD。GOD可以催化葡萄糖生成H2O2；生成的H2O2将在细胞内源性铁的作用下转化为ROS，进而诱导细胞铁死亡。同时，肿瘤细胞内葡萄糖被消耗，无法获取能量，抑制了肿瘤的生长。不同于一般纳米制剂，该制剂利用肿瘤的酸性微环境，开创性地实现了增加胶束通透性，使其能到达肿瘤部位，一定程度上达到了“靶向”效果，通过纳米胶束携带的GOD，既大量消耗了肿瘤细胞的能量物质葡萄糖，又利用生成的H2O2与内源性铁诱导铁死亡，实现了铁死亡与“饥饿疗法”的联合作用。此外，铁死亡和免疫调节的协同治疗也为肺癌治疗打开了一个新的窗口[38]。

4.4 结直肠癌治疗

结直肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤。目前主要采用手术辅助化疗，但效果不理想[39]。Mosafer等[40]开发了用适配体AS1411修饰的超顺磁性氧化铁纳米 粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticle，SPION）。该适配体负载了DOX和聚乳酸-羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）纳米颗粒。研究表明，AS1411修饰的纳米颗粒能够递送大量的DOX到达肿瘤部位，从而增强DOX对肿瘤细胞的毒性，这进一步说明这种纳米制剂在外磁场的作用下能够靶向肿瘤组织。该纳米制剂的特别之处在于上调p53的表达，对铁死亡途径有正向调节作用，能显著地抑制肿瘤生长。

4.5 宫颈癌治疗

宫颈癌是女性癌症排名中的第四大常见恶性肿瘤。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是宫颈癌复发转移的高危因素[41]。目前，科研人员已发现超声的空化作用可以将载体负载的药物在肿瘤部位有效释放，并产生高浓度ROS来提高疗效。如Li等[42]通过乳化法构建了以H2O2为内核，外壳载有Fe3O4纳米粒的PLGA囊泡（H2O2/Fe3O4-PLGA）。在超声作用下，囊泡在肿瘤部位发生裂解，原本封装的H2O2可以渗透并穿过降解的PLGA与装在聚合体膜内的Fe3O4发生芬顿反应，生成· OH诱发铁死亡。在人宫颈癌细胞小鼠模型中研究发现，H2O2/Fe3O4-PLGA给药组中小鼠体内的肿瘤已完全被消除，并且健康小鼠注入H2O2/Fe3O4-PLGA后无毒性和副作用。该制剂的优点在于可以通过超声作用实现肿瘤部位定向给药，极大地减少了给药量，并且对正常器官无毒性和副作用。H2O2/Fe3O4-PLGA也是良好的MRI造影剂，在micro-US诊断系统下可以同时进行治疗和成像。因此，铁死亡纳米制剂联合超声治疗宫颈癌是一种具有较大潜力的疗法。

4.6 鼻咽癌治疗

鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，其发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。近年来，顺铂药物与放疗的联合作用已成为局部区域晚期鼻咽癌的标准治疗模式。近期，Bejjanki等[43]制备了顺铂磁性四氧化三铁纳米药物，并在此基础上设计了靶向分子叶酸修饰的顺铂磁性四氧化三铁纳米药物，能实现主动靶向被肿瘤细胞摄取，并且能够响应肿瘤微环境释放出铁离子和顺铂，进而诱导肿瘤细胞铁死亡。该制剂创新性地选用叶酸受体为靶点，实现纳米制剂靶向给药，顺铂与铁死亡可发挥协同作用，极大地提高了疗效。

5 总结与展望

铁死亡作为一种新兴的细胞死亡方式，在癌症治疗方面有着巨大的潜力，其相关的作用机制仍需要进一步研究，协同肿瘤细胞铁死亡的多角度联合疗法将成为未来的治疗趋势。同时，新兴的纳米材料也在肿瘤细胞铁死亡中发挥着不可或缺的作用，如清除谷胱甘肽、生成大量H2O2、降低铁死亡对正常细胞的毒害作用等。此外，本文综述的铁死亡纳米制剂可以加速芬顿反应，降低细胞GPX4的活性和抑制肿瘤细胞中的Xc-系统，不仅延长了铁死亡在细胞中的发生时间，还改善了治疗肿瘤的靶向性。现有不少铁死亡纳米药物已经应用于临床研究中，可通过高通透性和滞留（enhanced permeability and retention，EPR）效应和对肿瘤微环境的刺激反应能力，在肿瘤靶向传递方面发挥了巨大的作用。此外，不同形式的铁死亡纳米制剂与基因治疗、气体治疗或免疫治疗等的联合治疗也在迅速发展。综上所述，虽然铁死亡纳米制剂在癌症治疗上的相关研究还处在起步阶段，针对各种癌症的作用机制也尚未完全阐明，但是其潜在应用前景巨大，必将成为未来肿瘤治疗的全新领域。