骨关节炎的可溶性生物标志物研究进展

2022-12-06李建平张凤综述彭飞审校

疑难病杂志 2022年4期

李建平，张凤综述彭飞审校

骨关节炎(osteroarthritis,OA)是老年人最常见的关节疾病，全世界有2.5亿人患病，并给整个社会和经济带来了巨大的负担[1]。骨关节炎生物标志物是关节组织转换产生的分子碎片，并释放到滑膜液、血液和尿液中，它们具有独特的动态变化、高敏感度和易于测量的特点，这些特性可能会克服目前评估OA方法的一些局限性，其中包括常规可溶性生物标志物、蛋白源性可溶性生物标志物、X型胶原可溶性生物标志物、软骨寡聚基质蛋白新表位、活性酶、骨膜蛋白、小分子核糖核酸，它们的出现为OA的诊断和预后提供帮助。本文对传统和最新的生物标志物的生化特征进行综述，并评估它们是否能解决目前OA治疗中的不足。

1 关节组织中常规的可溶性生物标志物

常规的生物标志物是用常规生物化学技术发展出来的生化指标，它们从组织中释放的确切结构和过程并不明确。主要的常规标志物详细描述并分为5类:疾病严重性、研究价值、预后、疗效和诊断，而所谓的BIPED分类是指合成代谢或分解代谢的标志物，即使这种区分并不总是完全准确的[2]。因为Ⅱ型胶原是软骨基质的主要有机成分，所以对软骨Ⅱ型胶原的形成和降解得到了广泛的研究。Ⅱ型胶原形成之前是通过测量血液中C端和N端肽(分为PⅡCP和PⅡNP)的水平来评估的。当前胶原转化为成熟的Ⅱ型胶原时，这些前肽被特定的蛋白酶剪切。PⅡNP以2种剪接替代形式存在，不同的是由PⅡNP高表达(PⅡANP)或PⅡNP低表达(PⅡBNP)。一种测定血清PⅡANP的方法已经开发出来，通常在胚胎中表达阴性但在OA软骨中表达相反。PⅡBNP主要在健康成人Ⅱ型胶原形成过程中表达。虽然PⅡANP和PⅡBNP应该反映相同的代谢过程，但是PⅡANP和PⅡBNP在来自OA患者的相同样本中评估时没有显著相关性。然而，与正常人相比，OA患者血液中这2种物质的水平均下降[3]。

2 关节组织中新的可溶性生物标志物

2.1 蛋白源性可溶性生物标志物最近，研究人员已经开始研究参与影响胶原形成的酶，这些酶用作第二代生物标志物，其中包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原酶，但是这些标志物具有不稳定性的缺点。研究者发现，许多方法可以直接或间接检测Ⅱ型胶原的存在[4]。研究指出Ⅱ型胶原生物标志物特异性抗体的识别受到脯氨酸羟基化的影响。OA中新合成的软骨中羟脯氨酸的含量高于正常软骨，这表明羟基化水平间接反映Ⅱ型胶原降解水平。因此，科学家们随后开发了三明治CIINE分析，识别胶原酶切割的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原的C端新表位，并对羟基化和非羟基化形式具有相似的亲和力。研究通过人尿夹心试验IB-C2C-HUSA的结果指出C端新表位序列与用于捕获抗体的CIINE的序列非常相似[5]。研究用CIIM检验Ⅱ型胶原的降解，这种方法可以产生更多的降解产物，因此可以在血清中测量[6]。CIIM和CTX-Ⅱ在OA患者软骨较正常者软骨高表达。EILCA法也可以检测血清CTX-Ⅱ。然而，在一项膝关节OA患者的研究中，血清CTX-Ⅱ水平与尿液CTX-Ⅱ水平不相关[7]。Ⅲ型胶原酶代谢也会影响骨关节炎的产生，检测方法分别为COL3-ADAMTS测定方法、竞争性Pro-C3检测、竞争性C3M检测和IIINys检测，这些标志物的差异性表达与OA的发生相关。

2.2 Helix-Ⅱ可溶性生物标志物 Helix-Ⅱ是最初用于测量人类Ⅱ型胶原降解的生物标志物。虽然用于检测Helix-Ⅱ片段的抗体早已发现，但是通过对人类软骨Ⅱ型胶原的直接测序证实之前公布的序列是不正确的，因此，Helix-Ⅱ对Ⅱ型胶原的特异性受到质疑。研究证实，4-羟脯氨酸的存在是Helix-Ⅱ抗体识别的关键[8]。因此，Helix-Ⅱ抗体的一个潜在靶点是Ⅲ型胶原，因为4-羟脯氨酸都存在于人类Ⅲ型胶原序列中。而Ⅲ型胶原在人软骨基质中大量存在，故检测起来相对简单。大量的实验数据表明，Helix-Ⅱ是评估关节炎中关节组织改变的一个有价值的标记。与性别和年龄匹配的健康对照组相比，膝关节OA患者和早期RA患者的尿液Helix-Ⅱ水平显著升高，经历抗肿瘤坏死因子治疗1个月后，血清Helix-Ⅱ水平下降明显。而在髋关节早期OA患者中，尿Helix-Ⅱ和尿CTX-Ⅱ联合测量比单独测量任何一种标志物更有效地发现疾病[9]。这种关系可能是由于Helix-Ⅱ和CTX-Ⅱ在OA软骨基质中的不同定位，以及它们从人类软骨胶原中产生的分解代谢酶的不同方式[10]。此外，由于Ⅲ型胶原既存在于滑膜组织，也存在于软骨组织，这使得Helix-Ⅱ成为OA独特综合生物标志物[11]。

2.3 Ⅹ型胶原可溶性生物标志物 X型胶原是一种非纤维性胶原，也是人OA软骨中高表达的肥厚软骨细胞分化的标志物，其中包含NC1结构域和胶原区域的可变部分，其核心为C-Col 10[12]。研究发现，与正常人相比，OA患者血清C-Col 10水平也与血清C2M水平显著相关，表明软骨细胞肥大与关节软骨降解密切相关[13]。最近研究利用气相色谱和质谱技术在OA患者的尿液中鉴定出组织蛋白酶K生成的Ⅹ型胶原螺旋部分的新表位，称为Col-10 neo[14]。在另一项研究中发现，OA患者的血浆Col-10 neo水平高于正常人[15]。在过去的几年里，针对由特定酶产生的Ⅱ型胶原新表位的第二代降解标记已经开发出来，并专门用于检测软骨基质中Ⅲ型和Ⅹ型胶原的降解。然而尚不清楚它们是否可以作为替代或比目前更成熟的胶原生物标志物联合用于评估OA患者。

2.4 全软骨寡聚基质蛋白(total cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、D-COMP、COMP新表位 COMP是关节软骨的一种非胶原蛋白。根据BIPED分类，血清COMP水平与OA疾病的诊断、疾病预后相关[16]。以往研究指出，血清COMP水平可以预测疼痛患者OA的发生率[17]。D-COMP是COMP蛋白的脱氨基形式。血清D-COMP水平与髋关节OA的严重程度相关，但与膝关节OA无关。相反，血清中总COMP水平与膝关节相关，而与髋关节无关，这表明D-COMP可能是关节特异性的[18]。最后，研究出2种针对总COMP和COMP新表位的自动检测方法。这2项检测的比值可以区分膝关节和髋关节OA患者的诊断[19]。

2.5 活性酶目前已经开发了多种方法能够测量可能与OA疾病有关的活性酶的浓度，特别是组织蛋白酶K和MMP-3的活性形式[20]。这2种酶都是作为原酶合成的，在激活过程中，信号肽被剪切，产生被特异性抗体识别的蛋白水解新表位，包括adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9。现研究出针对adamts-4、adamts-5、MMP-3和MMP-9的特异性检测方法。由于酶在体内广泛分布，预计当在血清中测量时，这些标志物对关节组织缺乏特异性[21]。此外，由于循环中活性酶的浓度很低，这类生物标志物的敏感度可能会受限。显然，活性酶浓度和OA之间的关系需要进一步的研究。

2.6 骨膜蛋白(POSTN) POSTN是由成骨细胞和软骨细胞合成的分泌蛋白，在软骨下骨和软骨基质之间对OA产生影响，贯穿OA疾病的全程[22]。在一项绝经后妇女的前瞻性研究中，膝关节OA患者血清POSTN水平显著低于对照组[23]。在另一项研究中，膝关节OA患者和对照组的血浆POSTN水平没有显著差异，但此项研究中POSTN采用不同的测定方法评估[24]。在以往研究中大量来自蛋白质或蛋白质片段的标志物已经开发出来。然而，只有少数对几个特征明显标志物进行了临床研究。为了分析它们在OA管理中的潜在临床效用，这些新的检测方法需要在技术上得到改进。

2.7 小分子核糖核酸表观遗传学是遗传学的一个领域，细胞表型的变化被认为是由调节基因活动的外部因素造成的。MicroRNAs(miRNAs)可能在OA中发挥关键作用，因为其中一些是参与软骨发育、稳态和骨关节炎病理的基因调控因子。一些体外和体内的研究已经证明，miRNA参与了OA的发生和进展，到目前为止，已证明46个miRNA与OA相关[25]。与对照组相比，患有轻度至中度OA的绝经后女性血清miR-146a-5p表达增加。重要的是，血清miR-186在未来4年将出现膝关节OA的女性中也会增加，因此它可能有能力检测膝关节OA的临床前水平[26]。研究人员还发现，与健康人相比，OA患者软骨中miR-146-5p显著上调，血清miR-146-5p水平升高，证实了该miRNA作为OA生物标志物的临床应用价值[27]。近期发现与对照组相比，OA患者的滑膜液中miR-140和miR-199水平下调，并与OA疾病的进展呈负相关，提示miR-140和miR-199可能通过调节MMP-3和IL-1β mRNA的表达影响相关金属蛋白酶和细胞因子的表达水平[28-29]。最后，长链非编码RNA可以影响OA发生和发展。表观遗传学极大地拓展了对OA发病机制的分子机制的认识。在一些小规模的研究中已经建立了一些miRNA标记，但在更大规模的研究中还有待研究。

3 影响OA诊治的可溶性生物标志物

3.1 影响OA表型的可溶性生物标志物在过去的几年里，在OA疾病表征方面的重要进展是将患者分为几种临床表型。表型对应一组具有某种疾病的共同可观察特征的患者，如形态学、发育、生化或生理特性或行为。这些表型会涉及特定的分子通路。而且OA是一种复杂的疾病，其表型可能是多种失调通路的结果。OA的表型包括炎性反应表型、代谢综合征表型、滑膜液表型和骨表型[30-32]。炎性反应表型的标志物包括血清hs-CRP、CRPM、C3M和内脂素，代谢综合征表型的标志物包含MMP-1、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10和MMP-12[33-34]，上述标志物的升高促进OA的发生。滑膜液表型升高促进OA发生发展[35]。骨表型包括α-CTX-Ⅰ表位和CTX-Ⅱ表位，这些表位表达增加对OA具有高骨转换状态的患者诊断有效[36]。疼痛的表型包括ADAMTS-5酶、TNF-α水平、IL-6、IL-8、血清COL3/ADAMTS水平，它们的升高对OA诊断具有帮助[37]。虽然许多表型已经提出，但目前用于这些表型的可溶性标志物似乎更有限。如果临床试验能将OA患者的表型与药物靶向的分子途径相对应，那么潜在药物的效果将更容易发现。

3.2 影响OA治疗、预后、发展的可溶性生物标志物影响早期OA预后的生物标志物包括血清COMP、透明质酸(HA)和Ⅰ型胶原交联N端肽(NTX-Ⅰ)、血浆葡萄糖烷、血清C2M、尿Coll2-1 NO2、血清C1M和尿CTX-Ⅱ，这些物质在早期OA中增加。影响OA发展的生物标志物包括血清PRO-C2、HA、IL-1、ARGS、PⅡANP、TLR4、COMP，尿CTX-Ⅱ、凝聚素肽、光蛋白聚糖、润滑素、弹性蛋白酶和滑液中TGF-β1水平，这些标志物在预测膝关节或髋关节OA疾病进展方面有效[38]。虽然一些临床和放射学研究证明其具有OA治疗的生物学价值，但是它们的敏感度和特异度差。因此，生物标志物具有互补的作用。研究发现，关节组织转换的生物标志物可能对OA治疗有帮助。研究表明，血清COMP水平升高的OA患者较血清COMP水平较低的患者治疗效果好[39]。有些生物标志物可以影响OA治疗效果，如血清CTX-Ⅱ、YKC-40、COMP和尿CTX-Ⅱ、NTX-Ⅰ，它们的降低对OA的治疗有很大帮助[40]。