基于改良科赫法则探讨炎性肠病微生态失调及微生物治疗策略

赵翰铮，游柳平，杨柳，于佳永，黄跃南

(哈尔滨医科大学附属第二医院普外科，哈尔滨 150001)

炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其发病率在西方国家较高，在发展中国家也呈上升趋势[1]。IBD病因复杂，环境因素、基因易感性及肠道微生态失调等均参与其中[2-3]。肠道微生物的组成发生改变、菌群多样性减少可导致共生微生物与潜在致病微生物之间的平衡被打破，即微生态失调，而肠道微生态失调可引发肠上皮细胞功能受损、致病菌识别功能缺陷和异常免疫反应等均是IBD发病机制的关键环节[4-6]。在单一病原体致病的范畴，科赫法则为证明有机体在疾病中的作用提出了标准。将人肠道的微生态失调看作IBD的致病病原体，若其满足科赫法则的条件则表明其与IBD发病之间的潜在因果关系。而微生态失调包括多种微生物及其复杂的相互作用，因此，当面对复杂的以群落为单位的病原体时，传统科赫法则(一种病原体对应一种疾病)就显得不够全面。现就基于改良科赫法则探讨IBD 微生态失调及微生物治疗策略的研究进展予以综述。

1 IBD与肠道微生态失调

人体胃肠道中约有100万亿个微生物，其中超过99%为细菌；成年人肠道中的细菌大部分属于拟杆菌属、副拟杆菌属和梭状芽孢杆菌属[7-8]。肠道微生物除了参与宿主营养代谢，还可通过调节机体的免疫系统和天然抗感染能力影响宿主健康[9-10]；同时，肠道微生物还与宿主昼夜节律转换、生理和疾病的易感性日波动有关[11]；此外，肠道微生物区系还可通过与潜在病原菌竞争营养位点、产生抗菌因子以及施加定植抗性防止潜在病原菌的生长，从而维持宿主生理活动的动态平衡[12]。宿主肠道内共生微生物区系的比例降低或多样性减少均会导致肠道的微生态失调，进而破坏宿主生理活动的动态平衡，引发一系列致病反应。

健康个体的肠道微生物具有高度个性化，但这种变化始终保持在健康平面，而IBD患者的微生物群波动则明显偏离健康平面，处于失调状态，表现为菌群组成改变、多样性减少且稳定性降低[13-14]。肠道正常菌属及其代谢产物在防御病原体定植与感染方面均具有重要作用，IBD患者肠道的正常菌属严重减少，同时伴随潜在致病种群增加，两者比例失调对疾病的发展起关键作用[15-17]。研究表明，IBD患者肠道内的双歧杆菌和乳酸杆菌大量减少，而这两种细菌具有免疫调节功能，可通过短链脂肪酸抑制机体炎症反应的进展、增强宿主肠道的防御功能，且双歧杆菌还可通过对乳酸的发酵降低肠道的pH值，从而防止致病性大肠埃希菌定植[18-20]。

肠道菌群失调可导致肠黏膜屏障功能减弱及促炎症状态[21]。在健康个体中，肠道屏障由一层完整的上皮细胞组成，其黏膜屏障可将微生物区系与宿主免疫细胞隔离，降低肠道通透性，而活动期克罗恩病患者上皮细胞之间的紧密连接则出现不连续状态[22]，由于存在微生态失调，个体机会性感染的可能性显著增加，导致黏膜低度炎症，进而使肠道通透性增加，屏障功能受损[23]。而肠道屏障受损又会进一步加重肠道炎症及微生物组成的改变，如此往复，最终导致系统性炎症的发生[24]。

肠道菌群失调还可影响肠道免疫功能。短链脂肪酸是肠腔中最丰富的微生物代谢物，被认为是肠道微生物区系影响肠道免疫功能的潜在介质，可通过激活巨噬细胞和树突状细胞调节促炎因子的表达，从而引起免疫系统的抗炎作用[25]。在肠道稳态条件下，过氧化物酶体增殖物激活受体γ可通过促进结肠细胞线粒体中短链脂肪酸的β氧化和氧化磷酸化，维持局部缺氧微环境，而专性厌氧短链脂肪酸产生菌在这样的环境中生长旺盛，兼性厌氧肠道病原菌的定植与生长则受到抑制，当肠道微生态失调时，兼性厌氧肠杆菌显著增加[26]，导致宿主肠道免疫系统抗炎作用受损，使肠道处于炎症易感状态。总之，伴随菌群失调的肠上皮功能受损和异常免疫反应可显著降低肠道对病原微生物定植的抵抗能力，而IBD患者肠道富含的致病菌群也会加剧肠道的病理反应，各种因素交互作用，导致IBD的发生。

2 基于“生态”科赫法则探讨微生态失调与IBD发病

生态学科赫法则由Vonaesch等[27]提出，即一种肠道生态系统状态对应一种疾病，主要内容包括：①在所有受影响的个体中均发现了组成相似/特征相似的失衡的微生物区系；②失衡的微生物区系可从患病宿主中获得；③将获得的失衡菌群放入无菌宿主体内，并使宿主处于相似环境中，宿主可产生类似的症状；④在新侵入的寄主中，失调的微生物区系组成保持相对稳定。与单一致病原引起相应疾病相比，生态学科赫法则强调了微生物区系的整体作用。利用生态学科赫法则，以失调的肠道微生物区系作为致病原研究其在IBD发病中的作用，通过将7种IBD相关肠道细菌进行组合，可得到一种简化人类细菌联合体(simplified human microbiota consortium，SIHUMI)。Eun等[28]成功将SIHUMI定植于实验小鼠体内，结果发现SIHUMI可以抗原特异性的方式诱发小鼠结肠炎。与单一病原体实验相比，该实验已取得进步，但与IBD微生物区系相比，相关细菌联合体并未体现出共生微生物区系与致病微生物区系之间的动态平衡关系，因此仍需进行失调菌群的整体实验。另据报道，人类肥胖相关的代谢表型可通过微生物区系移植传递给受体小鼠[29]，为IBD相关微生物区系移植实验提供了新思路。Schaubeck等[30]发现，无菌状态下的小鼠不会发生克罗恩病样回肠炎，研究者将克罗恩病回肠炎小鼠的盲肠进行疾病相关失调菌群分离，并移植至无菌环境基因易感性小鼠，结果导致无菌环境基因易感性小鼠发生克罗恩病样回肠炎，表明克罗恩病样回肠炎可通过失调的微生物群进行传递，即微生态失调作为致病因素，符合生态学科赫法则第2条和第3 条；进一步通过高通量测序分析发现，受者小鼠的盲肠菌群组成与供体菌群组成一致，且在新致病小鼠体内再次分离出了失调菌群，符合生态学科赫法则第 4 条。该研究结果首次证明实验状态下疾病相关菌群失调与克罗恩病样回肠炎的发生具有因果关系，为微生态失调作为IBD发病的中心因素提供了有力依据。以上关于生态科赫法则的实验结果均提示，微生态失调可导致IBD发生，而重新恢复微生物区系的平衡可诱导疾病的缓解。

3 微生物制剂在IBD治疗中的应用

调节肠道微生物菌群以恢复宿主与肠道微生物之间的平衡已成为治疗IBD的一个新方向。微生物制剂可以调节肠道微生物的组成及代谢活性，同时还可改善其与黏膜系统之间的关系。常用的微生物制剂主要包括益生元和益生菌，粪便微生物移植(fecal microbial transplantation，FMT)是近年研发的新兴治疗方案。

益生元是一种不可消化的碳水化合物，可选择性刺激共生微生物的生长并增加短链脂肪酸的产生，因此在IBD治疗中具有重要地位。Rufino等[31]的研究强调了益生元对结肠炎大鼠模型的治疗作用，包括促进乳酸杆菌和双歧杆菌的生长、短链脂肪酸产生增加、结肠肉眼病变减少以及炎症标志物的消退等。益生菌则被定义为活的微生物，当摄入量足够时，对宿主的健康有益。常见的益生菌包括乳酸杆菌属、双歧杆菌属和布拉酵母属。在IBD治疗中，益生菌的有益作用主要包括抑制病原菌的入侵、改善上皮屏障功能以及免疫调节等[32]。混合使用乳酸菌和VSL#3(益生菌组合)对儿童IBD患者具有显著疗效，且VSL#3还可有效诱导活动期溃疡性结肠炎缓解[33]。但目前对IBD中微生物群的了解及监测能力均有限，且益生菌相关临床试验并未针对可能导致IBD的微生物失调进行合理的设计。因此，根据IBD的现代微生物发病机制模式，应用宏观基因组测序技术筛选在IBD中具有生物学可信疗效的特定菌株，研究具有针对性的、特异的益生菌非常必要。

FMT是一种将健康供者的粪便微生物区系注入受者肠道的治疗方法。最初，FMT用于艰难梭菌反复感染患者的治疗并取得显著疗效[34]。FMT旨在恢复患者肠道微生物区系的动态平衡，因此有望成为IBD的一种有前景的治疗方法。一项双盲、随机、对照研究显示，与接受安慰剂(等渗生理盐水)的溃疡性结肠炎患者相比，大剂量、多供体 FMT的应用可增加患者肠道微生物多样性，并可有效地诱导活动期溃疡性结肠炎的临床缓解[35]。另有研究显示，接受FMT的患者粪便微生物多样性显著高于接受等渗生理盐水的患者，且两者不良反应比较差异无统计学意义；研究还显示，在6例捐献者中，有1例捐献者的粪便诱导了39%接受FMT的患者溃疡性结肠炎缓解[36]。表明FMT治疗在IBD患者中可能存在供者-受者相容性效应。Fang等[37]研究发现，使用新鲜或冷冻供体粪便、给药途径以及是否有抗生素使用史等因素对IBD患者的疗效均无影响。表明FMT是一种治疗IBD急性发作的潜在抢救疗法，甚至可作为初步的标准化治疗方案。但从理论上讲，FMT疗法可引发细菌相关性疾病，因此其主要局限在于长期疗效和安全性问题。FMT最常见的不良反应为腹痛，也可出现IBD复发、严重感染或死亡等严重不良反应。目前IBD相关 FMT治疗仍处于初级阶段，将捐献者与受者的微生物分析相结合，有助于建立患者的分类标准以及制订个性化的微生物治疗方案。未来仍需更多研究(包括给药途径、供体特性、治疗频率和持续时间)以确定IBD的最佳治疗方案，从而提高FMT治疗IBD的有效性和安全性[38-39]。

4 基于“共生”微生物科赫法则探讨IBD的微生物治疗策略

共生微生物科赫法则由Neville等[40]提出，即一种有益微生物可改善一种疾病状态，主要内容包括：①共生菌株与宿主健康有关，在健康宿主中定期出现，但在患病宿主中较少出现；②该共生菌可以作为培养物分离出来，并在实验室中生长；③当共生菌株被引入新的宿主时，可以改善或减轻疾病；④将共生菌株引入恢复健康的宿主，可检测到该共生菌株。利用共生微生物法则，通过补充IBD患者肠道共生微生物，可重新恢复肠道微生物区系的平衡，达到改善疾病状态或缓解临床症状的目的。乳酸杆菌和双歧杆菌菌属在健康个体中均具有重要的生理功能，但在IBD患者体内其数量则显著减少。研究者从健康小鼠粪便中分离出乳酸杆菌和双歧杆菌进行培养，并利用格拉姆(氏)法进行鉴定，同时将两类菌属组合形成个性化益生菌组合；通过研究葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型发现，口服个性化益生菌组合可显著缓解小鼠的患病体征，个性化益生菌组合通过有效调节宿主免疫应答抑制促炎因子的表达、促进抗炎因子的表达[41]。健康个体肠道微生物区系中的拟杆菌属具有重要的生理学功能，而IBD患者肠道中该菌属数量减少。Delday等[42]利用葡聚糖硫酸钠诱导及白细胞介素-10基因敲除两种IBD大鼠模型评估拟杆菌属中的重要组分多形拟杆菌对结肠炎的影响，结果显示，在葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎大鼠模型中，与应用多形拟杆菌培养基灌胃的大鼠相比，应用多形拟杆菌灌胃的大鼠体重降低显著改善、结肠组织病理学评分显著降低、炎症相关因子的表达显著下调；在白细胞介素-10基因敲除IBD大鼠模型中，与应用多形拟杆菌培养基灌胃大鼠相比，应用多形拟杆菌灌胃大鼠体重显著增加、组织病理学评分降低、结肠的炎症表现显著改善，且致炎因子的表达显著下调。以上研究表明，健康个体的微生物群移植可以通过补充共生菌群恢复肠道微生物平衡状态，减少肠道的炎症反应，这符合共生微生物科赫法则的1～3条。通过共生科赫法则既可逆向突显肠道微生态群落在IBD中的致病原作用，也可为IBD患者的微生物治疗提供新思路，因此未来通过进一步设计实验满足改良科赫法则非常必要。

5 小 结

宿主-肠道微生物生态系统的稳定对于人体健康至关重要，而IBD患者肠道呈微生态失调状态，究竟是微生态失调导致IBD发病还是IBD发病引发微生态失调目前尚不清楚。微生物制剂是一种有前景的IBD治疗方法，相关临床试验也取得了一定进展，但选择适宜菌株、减少不良反应、建立个体化治疗策略等方面仍面临重大挑战。利用改良科赫法则可以从正向(微生态失调可以传递疾病)和逆向(重建微生态平衡可以缓解疾病)两个方向突出微生态失调在 IBD发病中的重要地位。因此，未来进一步深入研究改良科赫法则与微生物群的关系，不仅有望揭示微生态失调与IBD之间潜在的因果关系，还可为IBD患者提供更加有效的治疗方案。