腹膜透析相关性腹膜炎动物模型的构建

王莹莹,沈瑞芬,梁耀军

(兰州大学第二医院肾内科，兰州 730030)

腹膜透析是终末期肾病的一种替代治疗方法。腹膜炎是腹膜透析最严重的并发症之一，是腹膜透析技术失败最常见的原因[1-2]。急性腹膜炎的特点是腹膜炎症细胞浸润、内皮交换面积增加、小溶质和葡萄糖转运增加、渗透梯度下降，最后导致超滤失败，透析液蛋白丢失增加[3-4]。理想的动物腹膜透析模型能够充分模拟人体腹膜透析过程，体现腹膜转运的病理生理学特点、结构变化以及腹膜局部防御机制，为临床前研究提供研究基础。腹膜透析动物模型的造模方法有多种，不同研究选择的实验动物种类和品系、造模方法、造模试剂等也存在差异[5-8]。腹膜炎动物模型可分为急性腹膜炎模型和慢性腹膜炎模型。急性腹膜炎模型造模时间短，研究单次腹腔注射造模介质对腹膜的影响，主要用于研究水和溶质的渗透性以及透析液、干预剂、炎症介质等的相互作用[9]。慢性腹膜炎模型的造模时间较长，是先给动物腹腔植入腹膜透析导管，通过导管灌注腹透液数天后再灌入造模试剂，主要用于评估长期腹膜透析后腹膜的变化，其过程更接近于人体腹膜透析过程。慢性腹膜炎模型可用于研究腹膜纤维化、包裹性腹膜硬化、反复发作的腹膜炎和腹膜形态学改变[10]。现从腹膜透析相关性腹膜炎动物模型的动物选择、造模试剂及具体操作方法、模型评价、模型应用等方面进行综述。

1 实验动物的选择

构建腹膜透析相关性腹膜炎模型的动物可分为大型动物(如家兔、狗、猪、羊、袋鼠)和小型动物(如大鼠、小鼠)，目前主要采用小型动物建模。每种动物模型都有其优点和缺点[3,6,11-14]。家兔的预期寿命长，腹膜透析导管植入更容易，但家兔较敏感，饲养和繁殖困难；鼠类易繁殖、费用低,但寿命较短、体积小,并发症发生风险高[12]。在腹膜透析相关性腹膜炎动物模型的构建中大鼠和小鼠使用最广泛，大鼠模型和小鼠模型造模方法、模型结果相似，主要区别是建立模型所需的时间和所使用的透析液或药物的剂量不同，大鼠模型的优点是可以获得更多的样本，特别是血液、腹透液和尿液样本。小鼠建模获得的样本量少，但由于转基因小鼠的应用，小鼠模型在机制研究方面具有优势[3,13-14]。如需了解腹膜透析对残余肾功能的影响，腹膜透析动物模型必须与肾功能不全模型结合使用，肾功能不全模型常采用5/6肾切除术，也可以采用双肾切除模型[3]。但在5/6肾切除和腹膜透析双重应激下模型动物存活率较低，如仅为了阐明腹膜透析过程中腹膜的变化，只需要建立肾功能正常的动物模型。腹膜透析相关性腹膜炎动物模型多采用肾功能正常模型。

2 造模试剂及剂量

细菌性腹膜炎是腹膜透析技术失败的主要原因，最常用的造模试剂为革兰阴性菌(常见为大肠埃希菌)及其来源的脂多糖，此外表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等也是引起腹膜透析相关性腹膜炎的常见细菌。此外，也可采用其他微生物(如酵母菌)致真菌性腹膜炎。

2.1脂多糖和革兰阴性菌 腹膜透析相关性腹膜炎动物模型造模选用最多的造模试剂为脂多糖，脂多糖主要来源于革兰阴性菌[14-16]。最常见的革兰阴性菌是大肠埃希菌，而脂多糖是大多数革兰阴性菌的细胞壁成分，也是炎症强有力的诱发剂，反复向动物腹腔内注射大肠埃希菌可导致腹膜持续炎症[15-17]。脂多糖大多来自大肠埃希菌，血清型为0111∶B4，造模方法是腹腔内单次注射脂多糖。在大鼠模型中，脂多糖的单次注射剂量为1 mg/kg；在小鼠模型中，脂多糖的单次注射剂量为10 mg/kg[15,17-18]。文献报道，单次给予脂多糖剂量为2 mg/kg时会致全部大鼠死亡，给予1 mg/kg时可致不同比例的大鼠死亡，给予<0.1 mg/kg剂量的脂多糖全部大鼠存活[19]。单次腹腔注射脂多糖，急性腹膜炎常发生在48 h内[17]。与脂多糖模型相比，大肠埃希菌暴露模型可诱导更强的白细胞浸润，透析液中白细胞数量显著增加，但两种模型中水通道蛋白1的表达均未发生变化[5]。小鼠模型可用采用109/ml菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)的大肠埃希菌稀释于2 ml透析液中进行造模[5,19]，或用2×107CFU，每周注射1次，共注射4次造模[16,19]。另外，通常在进行动物实验前应进行预实验以确定最终的注射剂量。

2.2革兰阳性菌 革兰阳性菌，特别是凝固酶阴性葡萄球菌，是腹膜透析相关性腹膜炎的常见致病菌[1-2]。表皮葡萄球菌是最常见的凝固酶阴性葡萄球菌，给予每只小鼠热杀伤表皮葡萄球菌5×108CFU，每周注射1次，共注射4次，小鼠可以存活49 d[14,20]。另有文献报道，给予每只小鼠腹腔注射表皮葡萄球菌5×108CFU的剂量不致命，急性感染发生在注射后24～36 h[16]。另一种方法是模拟与器械相关的腹膜炎，将拟植入的腹膜透析导管在表皮葡萄球菌1457中培养120 h，诱导导管生物膜形成，再将导管植入动物体内，每24小时冲洗1次导管进行造模[17]。

金黄色葡萄球菌是导致腹膜透析相关性腹膜炎的常见细菌，感染后表现为腹腔导管出口部位及隧道炎症、腹膜炎及腹腔脓肿。向C57BL/6 J和BALB/c小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌2×108CFU可导致0～25%的小鼠在15 d内死亡，接种量增加到(5～7)×108CFU，50%～70%的小鼠在24 h死亡，剂量继续增加至1×109CFU可导致90%的小鼠在12 h内死亡，尸检和组织病理学检查均显示接种点腹腔脓肿[12]。van Westrhenen等[21]分别给予大鼠含1×104、1×106、1×108CFU的金黄色葡萄球菌ATCC 25923悬液0.5 ml单次腹腔注射，结果发现,这3种剂量的细菌菌落都会导致大鼠发生非致命性腹膜炎，高剂量组大鼠存活率低于剂量组。

2.3其他微生物 真菌性腹膜炎是一种严重的并发症，致死率高，预后较差。酵母菌常用于腹膜透析相关性真菌性腹膜炎造模。真菌性腹膜炎多采用腹膜刮擦法进行造模，造模关腹时腹腔注射含有酵母菌悬浮液的高糖腹膜透析液5 mg/2 ml，关腹后继续给予酵母菌悬浮液直接注射，关腹后即刻5 mg/5 ml，关腹后2～4 d每日再给予10 mg/10 ml酵母菌悬浮液，共注射5 d，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌悬浮液在整个腹腔内扩散[22-23]。Mizuno和Ito[22]比较了不同剂量酵母菌造模的差异发现，腹腔壁厚度和炎症细胞数量与酵母菌剂量相关。

3 腹膜透析相关性腹膜炎造模操作

腹膜透析相关性腹膜炎造模法可概括为3种：腹腔直接注射造模试剂法、通过腹膜透析导管造模法以及腹膜刮擦法。

3.1腹腔直接注射造模试剂法 在麻醉或不麻醉动物的情况下消毒动物下腹壁，用注射器和针头直接向腹腔注射造模试剂或含有一定量造模试剂的透析液，皮肤穿刺仅限于腹部下象限，注射时左右下象限交替使用，注射过程中注意避免穿通肠管。重复注射会增加腹腔内出血和感染的可能，影响实验结果[8,24]。腹腔直接注射造模试剂法的优点是操作简便，建立模型需要时间短，是目前研究中最常选用的方法，该方法的缺点是易引起肠穿孔和透析液渗漏。

3.2通过腹膜透析导管造模法 动物麻醉状态下，在动物腹壁正中做一个小切口，然后将一根特殊的导管通过皮下隧道插入动物颈部或背部，将导管的另一端植入腹腔，最后缝合腹膜和腹壁[3,6,9-10]。每日通过导管给动物注射肝素配比的氯化钠或等渗氯化钠，防止导管阻塞。导管多为硅胶材质，直径和长度可以根据动物体型定制。通过腹膜透析导管给药的优点是能模拟腹膜炎的病理生理过程，可用于观察长期腹膜透析后腹膜的形态学变化，多用于研究反复发作性腹膜炎及导管定植菌相关性腹膜炎[6]。该方法的缺点是手术操作难度较大，饲养时感染风险较高，死亡率较高，导管的额外费用高[3]。同时腹腔导管植入增加了腹膜壁层白细胞滚动和外渗、腹膜纤维化和血管化风险[25]。腹膜炎过程中易发生导管堵塞和透析液渗漏[6,9]，通过导管给予肝素后又会对实验结果产生影响[8]。

3.3腹膜刮擦法 动物麻醉状态下，用15 ml的无菌聚丙烯管顶端以2次/s的频率机械刮擦动物右侧腹膜壁层60 s，刮擦方向每隔5 s转换1次(如由垂直方向改为水平方向或反之)，刮擦动物腹膜表面时，用钳子紧紧捏住打开的腹膜边缘，防止刮擦过程中腹膜移动。如果在实验结束时需测量腹膜功能，必须同时刮擦腹膜左右两侧[24,26]。切口缝合后通过腹腔注射酵母菌悬浮液，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌在整个腹腔内扩散，刮擦后1～7 d观察腹膜炎征象。腹膜刮擦法常用于真菌性腹膜炎造模，该方法的缺点是刮擦过程需要较高的技术[3,23]。

4 腹膜组织的处理及观察

4.1腹膜标本取样和处理 与腹膜透析患者不同，动物模型极少应用引流装置。膜透析相关性腹膜炎动物模型造模成功的诊断不能基于透析液细胞数量的增加，诊断的金标准是腹膜组织存在广泛的炎症细胞浸润[21]。腹膜组织非常脆弱，暴露在空气中会迅速干燥，易损伤,在处理模型动物时必须谨慎。剪腹壁时，动作要轻柔避免用力拉伸，在模型动物上腹部左上象限或腹部中线附近的左下象限或置管位置对侧的横切面收集壁腹膜[11]。壁腹膜覆盖在腹壁肌肉组织上，需与腹壁肌肉组织一同取下固定，注意避开穿刺部位。剪下肠系膜及网膜，留取脏腹膜。真菌性腹膜炎取腹膜标本前应仔细检查腹壁刮擦部位，确定取材部位[22]。收集壁腹膜和脏腹膜，标本用10%缓冲甲醛固定，石蜡包埋，薄切片；脏腹膜可用液氮冷冻[6,17,23]。

4.2腹膜病理学表现 腹膜炎的特征是腹膜白细胞浸润，病理切片上表现为腹膜厚度增加、明显水肿、大量单核细胞浸润，腹膜血管增生伴扩张[5,15,18]。组织切片可用苏木精-伊红染色和Masson染色，苏木精-伊红染色可观察腹膜炎症细胞浸润情况及腹膜厚度，Masson染色下测量腹膜厚度，在每个切片上随机取5～6个位置测量腹膜厚度，取其平均值。小天狼星红染色可用于观察胶原蛋白，采用内皮细胞标志物CD31标记后,沿腹膜横切面全长进行腹膜血管计数，记为腹膜血管数/mm。亦可用免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光等观察腹膜组织[5]。

5 腹膜平衡实验

腹膜平衡实验是监测腹膜透析过程中溶质和液体转运情况的重要方法，用于评价腹膜功能。腹膜平衡实验需要在短时间内收集腹膜透析液，常采用腹腔注射或向腹腔植入腹膜透析导管的方法注入透析液[3]。关于腹膜透析动物模型腹膜平衡实验的腹腔灌入量存在争议，通常大鼠腹膜透析模型的腹腔灌注量为10～30 ml，小鼠为1.5～2.5 ml[26]。大量灌注腹透液会引起模型动物疼痛和腹腔渗漏[3,18]。对于大鼠腹膜透析模型：通常向腹腔内注入25 ml含4.25%葡萄糖的常规腹膜透析液，保留4 h后收集腹腔内透析液，记录标本容积并测量尿素氮、肌酐、葡萄糖的水平，腹膜超滤量通过计算灌入前后腹透液差值获得，同时需通过尾静脉、颈内动脉或心脏穿刺留取动物血液标本。在小鼠模型中，接受2 h腹膜透析液交换，使用4.25%或7%的葡萄糖透析液2 ml进行腹膜平衡实验[18]。腹透液标本收集可以通过导管留取或将动物处死后打开腹腔收集残存的腹透液。为了便于收集腹腔内所有液体，打开腹膜腔时用巴斯德吸管收集透析液或使用称重法预先称重一块纱布，可通过计算纱布被腹腔液体浸泡前后的重量变化计算吸收的液体量[9,18]。

6 腹膜透析相关性腹膜炎动物模型的应用

腹膜透析相关性腹膜炎动物模型主要应用于：①腹膜透析相关性腹膜炎发生机制、腹膜结构及功能变化的研究，如水和溶质在腹膜中的转运、腹膜炎症过程中信号转导以及细胞因子、趋化因子和补体的作用等[15,17,20,27-30]。②观察某些新型阻断炎症因子的化合物在腹膜炎中的抗炎、抗氧化活性及可能的毒性作用，为后期治疗急性腹膜透析相关性腹膜炎提供依据[5,8,17]。

7 小 结

腹膜透析相关性腹膜炎仍是导致腹膜透析患者技术失败的主要原因之一,是终止腹膜透析转至血液透析的主要原因。研究腹膜透析相关性腹膜炎的一个重要步骤是建立可以模拟临床情况并可复制的动物模型，而腹膜炎动物模型的建立是实验基础研究中不可或缺的部分。腹膜透析相关性腹膜炎动物模型的构建过程要结合不同的研究设计方案、目的，选择不同的造模动物，合适的干预试剂及造模操作方法。腹膜炎模型建立过程中除了要注意实验动物操作过程中需普遍注意的事项外，还要掌握腹膜取样及保存方法，腹膜平衡实验实施过程的细节问题。目前腹膜炎动物模型相关研究中大多采用急性模型，但在反复发作性腹膜炎及导管定植相关的腹膜炎研究中仍需采用慢性模型。慢性肾衰竭模型并发症多，模型动物死亡率高，在腹膜透析相关性腹膜炎的动物模型中大多数采用肾功能正常的模型，不能完全模拟终末期患者腹膜透析的过程。因此，在未来腹膜透析相关的临床前研究中，仍需要积极探索更好的模拟终末期肾病人体腹膜透析过程的动物模型。