外周血游离核酸对消化道肿瘤诊断的应用进展

郭君燕 综述，戴一扬 审校

(浙江大学医学院附属第四医院，浙江 义乌 322000)

消化道肿瘤是临床常见的一大类肿瘤，在全球发病率前十位的肿瘤中占50%，且死亡人数均较高[1]，因此，早期诊断消化道肿瘤对于改善预后、减轻社会压力和疾病负担具有重要意义。外周血游离核酸(ccfNAs)是指存在于人体血液循环中的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括循环游离DNA和循环游离RNA等，本文将从上述2个方面入手，对ccfNAs在消化道肿瘤诊断方面的应用做一综述。

1 循环游离DNA

1.1概述 1948年，MANDELD等[2]首次发现，在血浆和血清中存在着游离DNA(cfDNA)。cfDNA是一种胞外DNA，主要来自于细胞的坏死和凋亡，在外周血中的水平随着年龄的增长而增加，且当机体处于某些疾病或特殊状态如创伤、脓毒症、无菌性炎症、氧化应激、运动、肿瘤等情况时也可升高[3]。在cfDNA中存在着一类位于血液循环中的来自肿瘤基因组的DNA片段，称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA仅占cfDNA的一小部分(有时小于0.01%)，半衰期通常小于2 h，主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞、肿瘤细胞释放DNA入血及循环肿瘤细胞裂解等途径，可携带有突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等基因变异特征[4]。

1.2分离与检测 cfDNA在血清中的含量远高于血浆，但由于易受到基因组DNA(gDNA)的污染，现有的证据更推荐将血浆作为分离检测的最佳标本[5]，其分离方法有相分离法、基于硅膜的离心柱法和基于磁珠的分级筛选法。

目前,已有研究表明，在消化道肿瘤患者的外周血中可以检测到cfDNA且与健康人群相比存在着DNA片段的差异[6]。其检测方法通常包含两大类：一类是以聚合酶链式反应(PCR)为基础的数字PCR(dPCR)、微滴式数字PCR(ddPCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、乳液微滴数字分析技术(BEAMing)等，另一类是以二代基因测序(NGS)为基础的标记扩增深度测序(TAm-Seq)、癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)、全基因组测序(WGS)、全外显子测序(WES)等技术。

1.3cfDNA在消化道肿瘤诊断中的应用

1.3.1cfDNA浓度 邱蕴文等[7]发现食管癌(EC)患者cfDNA浓度及完整性均高于食管良性病变及健康对照组，联合CEA和SCC后灵敏度可提高至95.6%和94.1%，表明cfDNA浓度可作为食管癌诊断的潜在生物标记。QIAN等[8]的研究指出Ⅰ期胃癌(GC)患者的cfDNA水平是健康人群的6倍且诊断效率显著高于肿瘤标志物如CEA、CA19-9、CA72-4和CA50。此外，YAN等[9]发现，原发性肝细胞癌(HCC)患者的cfDNA水平高于肝硬化患者，且血浆cfDNA与年龄、甲胎蛋白(AFP)联合检测HCC的诊断效能高于单用cfDNA或AFP。上述多项研究结果表明，cfDNA浓度在消化道肿瘤患者中显著升高，单一cfDNA或联合肿瘤标志物可作为消化道肿瘤诊断的检测指标。郑照正等[10]发现结直肠癌(CRC)患者的cfDNA浓度显著高于健康对照组，进一步将Ⅰ期、Ⅰ+Ⅱ期、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期以及Ⅰ-Ⅳ期CRC患者分别作为疾病组绘制ROC曲线，其AUC分别为0.667、0.636、0.685及0.753，提示尽管cfDNA浓度具有一定的辅助诊断价值，但作为早期诊断指标的准确性仍较低，或将导致部分患者漏诊。

1.3.2基因突变 HU等[11]利用血浆cfDNA检测肿瘤突变负荷(TMB)，发现右侧结肠癌较左侧更高，联合cfDNA浓度及CEA对CRC早期检测的AUC高于单用CEA，表明cfDNA对疾病的定位也有一定帮助。QU等[12]开发了一种名为HCC筛检的技术，通过联合检测cfDNA突变和血清生物标志物，旨在从无症状的HBsAg阳性个体中筛查出HCC患者，该项目在合并肝结节和(或)AFP水平升高的患者中检测灵敏度为85%，特异度为93%，进一步将此方法应用于队列研究，发现在HBsAg阳性且肝脏超声和血清甲胎蛋白水平正常的个体中的检测敏感度为100%，特异度94%。WANG等[13]发现，单独使用KRAS基因突变对Ⅰ～Ⅳ期胰腺癌患者诊断的敏感性依次为30%、46%、40%及83%，而联合CA19-9后其敏感性可提高至82%、82%、83%和89%，表明外周血游离核酸基因突变检测联合血清肿瘤标志物对消化道肿瘤的早期诊断也具有一定的潜在价值。

1.3.3cfDNA甲基化 DNA甲基化是一种常见的表观遗传学改变，通常是指通过DNA甲基转移酶的作用介导CpG二核苷酸胞嘧啶5′碳位甲基化形成5-甲基胞嘧啶的过程，在肿瘤的发生、发展中器重要作用。

LI等[14]发现，CDH1、DAPK、RASSF1A、RAR-β、p16基因甲基化在食管鳞癌(ESCC)患者中的检测水平较对照组高，其中前三者对ESCC诊断的灵敏度为62.2%～84.4%，特异度为80.0%～93.3%，若联合检测上述2种或2种以上基因甲基化，在将特异度提高至100%的同时仍可维持较高的灵敏度。另一项研究表明，CDKN2A、CDH1、DAPK1基因甲基化单独诊断GC的灵敏度为28.13%～40.62%，特异度为61.23%～70.21%，三者联合后灵敏度和特异性均较高，可作为GC诊断的分子标志物[15]。SALIMINEJAD等[16]发现，P16、RASSF1A、RPRM、RUNX3基因甲基化在GC患者中的表达水平有所升高，单独检测RPRM基因和RUNX3基因甲基化对早期胃癌的诊断有一定帮助，同时联合二者将进一步提高诊断水平。

甲基化SEPT9基因(mSEPT9)可参与细胞的凋亡、增殖等多项过程，是调控肿瘤发生发展的关键因子，现已被美国FDA批准应用于结肠癌的早期筛查，但现有的研究也不局限于结肠癌。SONG等[17]将mSEPT9检测运用于EC、GC、CRC及HCC患者后发现其检测敏感性分别为42.6%、47.7%、76.6%及77.7%，提示mSEPT9对CRC及HCC的检测效力相当，而在GC和EC中的检测效力较弱。而在早期胃癌(EGC)患者中，曹长琦等[18]发现，mSEPT9甲基化的阳性率为28.4%，与RNF180联合后可提高检测灵敏度至40.5%。沈志明等[19]发现，HCC患者的SEPT9甲基化阳性率高于胆管细胞癌和健康对照组，联合GGT对HCC诊断的灵敏度为88.6%，特异度为68.3%，表明该基因在提高HCC诊断水平的同时也有助于与胆管细胞癌的鉴别诊断。OUSSALAH等[20]将mSETP9应用于肝硬化患者HCC检测的AUC为0.940，其中对于巴塞罗那分期为A期的患者，AUC为0.863。此外，对于HCV相关肝硬化患者而言，mSETP9对HCC检测的准确性高于AFP，提示在cfDNA甲基化检测一定程度上能更灵敏的反应肿瘤的信息。

2 循环游离RNA

2.1概述 CfRNA是指存在于血液、尿液、肺泡灌洗液、胸腹水等体液中的胞外RNA(exRNA)，主要包括信使RNA(mRNA)、小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(IncRNA)、环状RNA(circRNA)等，其中存在于血液中的游离RNA即为循环游离RNA。cfRNA的来源目前仍尚未明确，ZHOU等[21]开展的体外试验发现，exRNA浓度可在缺氧及细胞代谢速率增加时升高，这或许可以解释cfRNA在肿瘤患者中升高的现象，但该发现还未在在体试验中得到证实。

2.2分离与检测 由于血浆中存在大量的核糖核酸酶，cfRNA通常与脂质、蛋白质或膜泡结合以复合物的形式存在以避免被降解，高纯度的RNA分离与检测现今仍是一大难题[22]。常用的分离方法主要包括异硫氰酸胍-酚提取法、胍盐-β巯基乙醇提取法、硅胶膜离心吸附柱法、Trizol法等，检测方法与cfDNA相类似，主要为各类PCR及二代测序(NGS)技术，其中qRT-PCR是RNA定量检测的金标准[23]。

2.3CfRNA在消化道肿瘤诊断中的应用

2.3.1循环mRNA 循环mRNA水平在消化道肿瘤患者与健康人群中的表达也存在差异。丽敏等[24]发现，人端粒反转录酶(hTERT)mRNA对GC诊断具有较高的灵敏度(84.8%)和特异度(82.7%)，与传统的肿瘤标志物联合后还可以有效降低胃癌漏诊率。ABDEL GHAFAR等[25]的研究表明，血清中Metadherin mRNA诊断CRC的敏感性和特异性均高于粪便潜血检测及CA199、CEA等肿瘤标志物，表明循环mRNA检测在某种程度上优于传统的肿瘤标志物。

此外，HAN等[26]发现，血清RIPK3 mRNA可辅助AFP提高早期肝癌的诊断效率，但目前仍缺乏进一步的前瞻性多中心临床试验。DENG等[27]发现，MCM2和NUSAP1 mRNA在胰腺癌细胞系和组织中的表达水平均较健康人群升高，但仍缺乏血清学研究证据，表明循环mRNA也可作为消化道肿瘤诊断的标志物，但仍需要更多的临床研究结果证实。

2.3.2循环miRNA miRNA作为短单链RNA序列，可与靶基因的3′-UTR进行碱基互补配对介导调控原癌基因、抑癌基因等下游靶基因的表达，由于与下游靶基因联系密切，可将miRNA失调作为诊断工具早期识别肿瘤的发生。ZHANG等[28]的研究显示，miR-21、miR-223、miR-375可作为食管癌尤其是0～Ⅰ期和Tis～T1期ESCC诊断的生物标志物，其AUC分别为0.80、0.73、0.69。2010年TSUJIURA等[29]的研究证实miR-106b在GC患者中表达升高，而let-7a则表达下降，利用miR-106b/let-7a比值对GC患者诊断的AUC为0.879。有研究提出可通过联合miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142-5p和miR-376c-3p，这4种miRNA对CRC进行检测，在Ⅰ期或Ⅱ期CRC患者中也显示出较高的诊断性能[30]。

3 结语与展望

综上所述，外周血游离核酸检测在消化道肿瘤的早期诊断方面具有深远而广泛的应用价值。但现有研究仍存在一定的局限性。一方面，ccfNAs的检测技术缺乏相关行业标准，不同的研究在样本采集、保存、运输及操作方面均有所区别，使得研究结果之间存在较大差异；另一方面，多数研究纳入的样本量过小，缺乏多中心、大规模的前瞻性临床研究，使得研究结果的临床应用及推广受到一定限制。目前,ccfNAs的研究正处于高速发展之中，相信随着现有技术及研究的不断深入，在不久的将来ccfNAs可广泛应用于临床，在消化的肿瘤的早期诊断及精准治疗方面发挥巨大的作用。