多发性骨髓瘤CAR-T治疗的研究进展

胡坭坭 综述，肖 青审校

(重庆医科大学附属第一医院血液内科，重庆 400016)

多发性骨髓瘤(MM)是骨髓中的浆细胞异常克隆增殖，引起靶器官损害的恶性肿瘤，发病率约占血液系统恶性肿瘤的13%，仅次于淋巴瘤。根据传统的DS分期系统及修订的国际分期系统(R-ISS)分为Ⅰ～Ⅲ期，分期越高，其5年总体生存率(OS)及5年无进展生存率(PFS)越低，预后越差[1]。目前，MM仍无法治愈。新一代蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、免疫治疗、自体干细胞移植使MM的生存时间及预后得以改善[2]。嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞免疫疗法为治疗MM的一种新兴手段，本文将对近几年来MM的CAR-T治疗的进展进行综述。

1 CAR-T的原理

CAR是一种人工合成的新型受体，第一代CAR包括来自单克隆抗体可变结构域的单链可变片段(scFv)和来自T细胞的胞内信号结构域；第二代CAR在此基础上引入额外的共刺激结构域如CD28、4-1BB，可增强其信号传导；第三代CAR有2个共刺激结构域；第四代CAR还可表达细胞因子如白细胞介素(IL)-12促进T细胞增殖。CAR的杀伤作用不受主要组织相容性复合体(MHC)分子限制。通过基因工程，用携带编码CAR基因的慢病毒或逆转录病毒载体转导T细胞，重组的T细胞由细胞外靶向区域和通过铰链跨膜区域连接的各种细胞内信号域组成，体外扩增以后回输到患者体内，以识别、结合并裂解靶细胞。CAR-T细胞可将单克隆抗体的靶特异性与T细胞的细胞毒性相结合[3]。

2 CAR-T的靶点

CAR-T治疗的一大重点即寻找特异性较高的理想靶点，既能发挥杀伤靶细胞的疗效，又能避免损伤周围正常细胞。目前，临床研究的靶点主要有以下几类。

2.1单靶点CAR-T

2.1.1B细胞成熟抗原(BCMA)靶点 BCMA属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，通过与其配体结合，调节B细胞的增殖、存活、成熟和分化。BCMA仅在B细胞谱系上表达，在恶性浆细胞表面表达也明显增高。故为目前多发性骨髓瘤CAR-T治疗的较理想靶点[4]。

2016年ALI等[5]在12例复发/难治性多发性骨髓瘤(RRMM)患者中开展了BCMA CAR-T细胞的首次人体Ⅰ期剂量递增临床试验，CAR-T细胞输注前先用环磷酰胺+氟达拉滨预处理。输注剂量水平范围为0.3×106～9.0×106kg-1。在前3个剂量水平显示出的有效性和毒性有限。2例接受9×106kg-1治疗的患者观察到明显的毒性和缓解率，1例获得66周的部分缓解(PR)，1例获得持续17周的完全缓解(CR)，同时也观察到细胞因子释放综合征(CRS)和血细胞减少时间延长的不良反应。

百时美施贵宝(BMS)和蓝鸟公司(Bluebird Bio)开发了bb2121，是由慢病毒载体构建的鼠源二代 BCMA CAR-T，以4-1BB为共刺激结构域。36例RRMM患者参与了一项多中心Ⅰ期临床研究[6]，分为剂量递增阶段和剂量扩展阶段，前者输注的CAR-T细胞剂量为50×106、1 509×106、450×106、800×106。后者为150×106～450×106，输注前用氟达拉滨+环磷酰胺预处理。3例患者因病情进展退出研究，其余33例患者的总体缓解率(ORR)为85%，中位无进展生存期(PFS)为11.8个月。所有缓解(≥PR)且可评价微小残留病灶(MRD)的16例患者均达到MRD阴性状态(≤104水平)。最常见的3级以上不良事件为血液学毒性反应，85%发生中性粒细胞减少，58%发生白细胞减少，45%发生血小板减少和贫血。在76%的患者中观察到CRS(≥3级占 6%)，在42%的患者中观察到神经毒性效应(≥3级占3%)。接受较高剂量的患者(150×106或450×106)获得了更好的缓解和更长的缓解持续时间。BMS/蓝鸟公司在RRMM患者中开展了Ⅱ期临床研究(KarMMa-2)以进一步评估bb2121的疗效和安全性,128例患者接受了剂量范围为150×106～450×106CAR-T细胞输注。中位随访时间11.3个月，ORR为94%，中位PFS为8.6个月。CRS发生率为83.6%(≥3级占5.5%)，神经毒性效应发生率为18%(≥3级占3.1%)。上述研究证实了bb2121对于RRMM是一种有效的选择。2021年3月27日BMS/蓝鸟公司宣布FDA批准bb2121(ide-del)上市，用于4线治疗后的RRMM患者，是首款上市的MM CAR-T产品。蓝鸟公司在bb2121离体培养过程中加入PI3K抑制剂结构域，设计出了一种新的CAR-T产品即bb21217，可通过富集记忆样T细胞群从而增强T细胞的持久性和效力。在RRMM患者中进行了bb21217的Ⅰ期剂量递增试验[7]，18例患者中15例中观察到临床缓解，但6例随后复发。

宾夕法尼亚大学的团队利用慢病毒载体构建了一种全人源的BCMA CAR-T，相比鼠源化的CAR-T，可以减少免疫源性，减轻排斥反应。在RRMM患者中进行了一项Ⅰ期研究[8]，25例受试者分为三组：组1直接回输1×108～5×108CART-BCMA细胞；组2先使用环磷酰胺预处理，再回输1×107～5×107CART-BCMA细胞；组3先使用环磷酰胺预处理，再回输1×108～5×108CART-BCMA细胞。3个队列的总体反应率分别为44%、20%和64%，中位PFS分别为2.2、1.9、4.2个月。总体CRS发生率为88%(≥3级占32%)，总体神经毒性效应发生率32%(≥3级占12%)。

P-BCMA-101是一种全人源化二代BCMA CAR-T产品，利用与第二代CAR支架(CARTyrin)融合的抗BCMA CentyrinTM，采用piggyBacTM转座子系统制成，提高了亲和力和稳定性，降低了免疫原性。其Ⅰ期试验在12例RRMM患者中进行，结果示6例接受评价的患者的ORR为83%，其中1例发生2级CRS，但尚未出现更充分支持该药物疗效和安全性的其他数据[9]。

LCAR-B38M是一种利用慢病毒载体构建的靶向BCMA双表位的鼠源二代CAR-T。有研究进行的Ⅰ期多中心研究(LEGEND-2试验)入组了57例RRMM患者。使用环磷酰胺预处理，然后分3次(分别为总剂量的20%、30%、50%)输注剂量范围为0.07×106～2.1 0×106的LCAR-B38M CAR-T细胞[10]。57例患者中共有50例缓解；ORR为88%，68%达CR，5%达非常好的部分缓解(VGPR)，14%达PR。63%患者MRD阴性。中位随访8个月，中位PFS为15个月。65%患者报告大于或等于3级不良反应，其中最常见的是白细胞减少(17/57)、血小板减少(13/57)和天冬氨酸转氨酶升高(12/57)。90%患者发生CRS(≥3级占7%)。1例患者报告了1级失语症、激越和癫痫样活动的神经毒性，经地西泮治疗后消退。表明LCAR-B38M CAR-T细胞治疗在RRMM患者中表现出深度和持久的缓解及可管理的安全性特征。

还有研究者将注意力转向了使用健康供体来源T细胞开发同种异体BCMA靶向CAR-T。但同种异体CAR-T细胞可诱导移植物抗宿主病(GVHD)。使用基因编辑技术破坏内源性TCR可限制GVHD的风险[11]。SOMMER等[12]开发了ALLO-715，为一种同种异体BCMA CAR-T细胞，评估ALLO-715产品安全性和有效性的Ⅰ期临床试验正在进行中。

总之，BCMA是目前MM CAR-T治疗应用最多，研究最深入的靶点。BCMA CAR-T治疗MM的临床试验结果显示较高的ORR。但这些缓解的持久性相对有限，部分患者甚至复发。

2.1.2SLAMF7靶点 信号淋巴细胞活化家族(SLAMF7)又称CS1，是一种细胞表面糖蛋白，广泛高表达于骨髓瘤细胞表面，而在正常细胞上表达有限。BCMA CAR-T治疗的CR率为30%～70%，但缓解通常不持久。与BCMA相比，SLAMF7在骨髓瘤细胞上的表达更均匀，在其他免疫细胞的表达较少。BCMA CAR-T后复发的患者可能从CS1 CAR-T中获益。CHU等[13]构建了CS1 CAR-T细胞，并用原位MM 异种移植小鼠模型测试其效果，结果提示在体外CS1 CAR-T细胞分泌更多的干扰素-γ(IFN-γ)及IL-2，显示出更强的细胞毒性。在原位MM异种移植小鼠模型中，CS1-CAR可有效抑制人骨髓瘤细胞的生长，并延长小鼠生存期。有研究检测了CS1 CAR-T的体内疗效，所有接受CS1 CAR-T治疗的荷瘤小鼠存活大于 100 d而对照小鼠的中位生存期为43 d[14]，进一步验证了CS1作为骨髓瘤免疫治疗靶点的实用性。

2.1.3GPRC5D靶点 孤儿G蛋白偶联受体C组5成员D(GPRC5D)也是一个潜在靶点。SMITHERIC等[15]证明GPRC5D在恶性骨髓浆细胞上表达，而正常组织表达仅限于毛囊。他们开发了一种人源化的GPRC5D CAR-T细胞，发现其可根除异种移植模型中的MM细胞，在小鼠中不会引起明显的毒性或病理学。上述研究提供了GPRC5D靶向CAR-T细胞治疗候选药物安全有效的临床前证据。

2.1.4CD19靶点 靶向CD19的Car-T治疗在淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤中应用潜力较大，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准2种CD19 CAR-T细胞产品分别用于急性淋巴细胞白血病(ALL)和B细胞淋巴瘤(BCL)的治疗[16-17]。由于CD19仅在少数骨髓瘤细胞上表达，靶向CD19的CAR-T(CTL019)单独给药可能不会产生临床缓解。因此，GARFALL ALFRED等[18]将CTL019与高剂量美法仑和自体干细胞移植相结合，共纳入12例MM患者，其中10例患者在接受高剂量马法兰和ASCT后12～14 d接受5×107CTL019输注，2例患者PFS显著延长(479 dvs.181 d；249 dvs.127 d)。CTL019可能通过靶向和促发针对骨髓瘤增殖细胞的二次免疫应答，延长标准MM治疗的缓解持续时间。

2.1.5CD38靶点 CD38是一种单链Ⅱ型跨膜糖蛋白，参与细胞黏附、信号转导及钙浓度调节，在骨髓瘤细胞表面表达水平高且均匀，靶向CD38的单克隆抗体达雷妥尤单抗于2015年被FDA批准用于RRMM的治疗，这支持了CD38可作为MM CAR-T治疗靶点的观点。但CD38在造血祖细胞亚群和部分正常造血细胞上也有中等水平表达，因此如何提高特异性，减少靶点外的不良反应为CD38 CAR-T治疗需解决的问题。DRENT等[19]构建了以4-1BB为共刺激结构域的CD38 CAR-T，并引入caspase-9(iCasp9)自杀基因控制CD38 CAR-T细胞的死亡以减少不良反应。临床前研究成果提示CD38 CAR-T对于CD38+的MM有治疗效果，与免疫检查点抑制剂等联用可以提高疗效。纳米抗体，也称为单结构域抗体(sdAbs)，是美洲驼中天然存在的重链抗体的可变结构域[20]。有体积小、稳定性好和单结构域特点。AN等[21]开发了一种新的抗CD38纳米抗体(Nb-1G3)，以慢病毒为载体，构建了由该纳米抗体作为靶向结构域、4-1BB为共刺激结构域的CD38 CAR-T，可有效且特异性地裂解CD38+MM细胞系，对成熟T细胞、B细胞和NK细胞的CD38+组分毒性轻微。CD38 CAR-T在体外表现出显著的CD38+特异性细胞毒性和抗骨髓瘤作用。在体内可抑制CD38+MM细胞系的小鼠的肿瘤生长。

2.1.6CD229靶点 CD229是一种存在于B和T淋巴细胞上的细胞表面受体，在MM浆细胞上普遍强烈表达，为MM CAR-T治疗潜在靶标[22]。有研究设计了第一个全人源CD229 CAR-T，临床前研究发现CD229 CAR-T在体外和体内对MM浆细胞、记忆B细胞和MM繁殖细胞表现出强烈和持续的活性[23]。

2.1.7κ轻链靶点 成熟B淋巴细胞仅表达κ或λ轻链中的一种。RAMOS等[24]开发了一种特定于κ轻链的二代CAR-T，可识别并杀伤κ限制性细胞，保留λ限制性B细胞，将体液免疫损伤降至最低。Ⅰ期临床试验中7例MM患者接受了0.2×108～10.0×108CAR-T输注。治疗后4例患者病情稳定(SD)时间持续2～24个月，其余3例无反应，1例患者发生与κ CAR-T输注可能相关的3级淋巴细胞减少不良反应。

2.1.8免疫受体NK细胞受体G2D(NKG2D)靶点 NKG2D是一种Ⅱ型蛋白，是NK细胞、T细胞上表达的活化受体。其配体在MM表达，在健康组织中通常不存在。因此，基于NKG2D的CAR-T细胞具有应用潜力。SUSANNE BAUMEISTER等[25]在5例RRMM患者中进行了一项NKG2D CAR-T的Ⅰ期剂量递增研究，单次输注4个剂量水平(1×106～3×107NKG2D CAR-T细胞)，输注前不进行淋巴细胞耗竭预处理。未观察到客观缓解，也未观察到剂量限制性毒性、CRS或神经毒性，提示NKG2D CAR T细胞扩增和持久性有限，有待进一步研究增强NKG2D CAR-T细胞扩增和靶密度，以增强临床活性。

2.2多靶点CAR-T 为了增加靶抗原水平，减轻单靶点CAR-T治疗的抗原逃逸，研究者们开始着眼于开发多靶点CAR-T。主要有以下几种形式[26]：(1)Dual CAR，即采用双顺反子表达载体制备同时携带2种CAR的CAR-T细胞。(2)CAR pool，即相继或同时输注2种或者多种针对不同靶抗原的 CAR-T细胞。(3)单链双特异性(OR-gate)CAR，即在同一表达载体上串联表达2个抗原识别区。有研究表明Dual CAR疗效优于 CAR pool[27]。

2.2.1靶向BCMA和CD19 徐州医科大学附属医院进行了一项Ⅱ期临床试验[28]，21例患者同时输注人源化抗CD19 CAR-T细胞(1×106kg-1)和鼠抗BCMA CAR-T细胞(1×106kg-1)。中位随访179 d时20例(95%)出现缓解，包括9例SCR、3例CR、5例VGPR和3例PR。最常见的不良事件为CRS(19/21)，其中18例为1～2级CRS。常见的大于或等于3级不良事件多为血液学毒性反应，包括中性粒细胞减少症(86%)、贫血(62%)和血小板减少症(62%)。说明双重CAR-T细胞组合可能是RRMM的一种有前景的治疗选择。苏州大学附属第一医院[29]采取第0天输注抗CD19 CAR-T细胞，第1天(40%)及第2天(60%)输注抗BCMA CAR-T细胞治疗16例RRMM患者,总有效率为87.5%(14/16)，12例达CR，2例达PR,所有患者输注CAR-T细胞后体温和炎症因子水平均急剧升高(均发生CRS)，但经适当治疗和护理后恢复至正常水平。

2.2.2靶向BCMA和CS1 EUGENIA等[30]设计了BCMA/CS1单链双特异性(OR-gate)CAR-T，也称BCMA/CS1串联CAR-T，同时靶向BCMA和CS1，利用了CS1的均匀表达和强大的抗原性及BCMA靶向诱导的强抗肿瘤作用，可以在体外和体内强有力地消除瘤小鼠的异质性MM细胞，防止BCMA损失导致的肿瘤逃逸，提高CAR-T细胞治疗的疗效，还证明了抗PD-1抗体与OR-gate CAR-T细胞联合给药可以加快已植入高度侵袭性MM异种移植物的动物的初始肿瘤根除率。

2.2.3靶向BCMA和CD38 有研究对22例RRMM患者进行了双靶向CD38、BCMA CAR-T细胞疗法(BM38 CAR-T)的首次剂量递增Ⅰ期临床试验，输注前使用氟达拉滨和环磷酰胺预处理，输注剂量为0.5×106～4.0×106kg-1的BM38 CAR-T细胞[31]。ORR为90.1%，54.5%的患者达到SCR，7例达PR，2例达VGPR。9个月PFS率为78.9%。在90.9%患者中观察到CRS(≥3级占22.7%)，未观察到神经毒性，证明了BM38 CAR-T有较高且持续的缓解率，不良反应可控。

2.2.4靶向BCMA和TACI 和BCMA类似，跨膜激活剂及钙调节剂和亲环素配体(TACI)也是TNFR超家族成员，几乎仅在浆细胞上表达，并且在大多数骨髓瘤细胞上呈现高水平表达，BCMA和TACI的天然配体是增殖诱导配体(APRIL)。ANDREA等[32]开发了一种基于三聚体APRIL结合域(TriPRIL)的二代CAR，可增强与BCMA和TACI的结合，预防BCMA逃逸。TriPRIL CART在体外和体内异种移植小鼠模型中MM细胞系的活性均增强。LEE等[33]设计了第三代基于ARRIL的CAR(ACAR)，使用截短形式的APRIL作为肿瘤靶向结构域，同时识别MM细胞上的BCMA和TACI。与单独靶向BCMA相比，BCMA和TACI的双抗原靶向促进在BCMA下调或丢失的情况下持续的疾病抑制。POPAT等[34]正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验以评价APRIL CAR-T细胞在RRMM患者中的安全性和疗效。对11例RRMM患者输注15×106、75×106、225×106、600×106、900×106的APRIL CAR-T细胞。在接受大于或等于225×106CAR-T细胞的患者中，ORR为42%。

2.2.5靶向CD38和CD138 有研究开发了一种双靶向CD138、CD38的CAR(dCAR138-38)，并进行了体内、体外的临床前研究，结果示接受dCAR138-38治疗的MM荷瘤小鼠的中位生存期平均为97.4 d，而对照组为30 d，与未接受CAR治疗相比，最低剂量下也能改善小鼠的存活率[35]。表明dCAR138-38在体外和体内均可引起瘤小鼠的强效抗MM应答，可能为MM患者提供一种强效、安全的替代疗法，但仍需要相应的临床研究以进一步证实。

3 CAR-T治疗的不良反应

CAR-T治疗2种最常见的急性不良反应(AE)是CRS和神经系统事件，也称为CAR T细胞相关性脑病综合征(CRES)，最近也被称为免疫效应细胞相关性神经毒性综合征(ICANS)[36]。若早期干预，这些AE是可逆转的，但若不早期管控，可能会演变成重度AE，甚至危及生命。

3.1CRS CRS的发生是由于肿瘤细胞清除过快和多种细胞因子的释放。当CAR-T细胞与其靶抗原结合时，它们增殖、产生细胞因子和细胞毒性分子，介导肿瘤细胞的破坏。当细胞被破坏时，它们释放CK和其他免疫效应细胞进入循环[37]。该“细胞因子风暴”后观察到血管通透性和第三间隙液体增加，可导致血管舒张、心输出量减少和血管内容量耗竭[38]。CRS通常发生在CAR-T细胞输注后第1周内，最常见的症状为高热、低血压和缺氧，按症状轻重分为1～4级。低级别CRS可通过支持治疗进行管理。高级别CRS如持续性和难治性发热或低血压，可能需要托珠单抗(actemra)(一种抗IL-6受体拮抗剂)和(或)皮质类固醇进行治疗[39]。

3.2神经系统事件 神经系统事件的可能原因包括细胞因子通过血脑屏障被动渗漏和T细胞转运至中枢神经系统[36]。神经系统事件可能呈双相，第一阶段与CRS症状同时发生，通常在CAR-T治疗后的前5 d内，对抗IL-6治疗有反应。高剂量托珠单抗也可能加重神经系统事件。神经系统事件按严重程度可分为1～4级，特征症状为意识模糊、激越和谵妄。重度病例还可出现理解性或表达性失语、迟钝、惊厥或非惊厥性癫痫发作和脑水肿。对于并发CRS的大于或等于1级神经系统事件，可使用托珠单抗。与CRS无关的大于或等于2级神经系统事件可以使用皮质类固醇治疗，剂量取决于事件级别。在治疗神经系统事件的同时，还应预防癫痫发作和颅内压升高[40]。

3.3其他不良反应 CAR-T细胞治疗的长期和晚期不良反应可能包括B细胞再生障碍性贫血导致的低丙球蛋白血症和血细胞减少，二者均可增加感染风险。恶性和正常B细胞表面均表达CD19，导致抗CD19 CAR-T细胞治疗后的“靶向，非肿瘤”B细胞再生障碍性贫血，可能持续数月至数年，并可能导致频繁感染。患者可能需要免疫球蛋白治疗。CAR-T治疗也可诱导免疫介导的全血细胞减少[41]。

4 CAR-T 耐药机制与应对措施

MM对CAR-T细胞治疗耐药的潜在机制是表达较低水平靶抗原的肿瘤细胞逃逸(抗原逃逸)、免疫排斥反应、可溶性形式的靶抗原(如sBCMA)对CAR的阻断。靶抗原缺失或下调至低于CAR-T细胞活性所需阈值水平会导致抗原逃逸，同时靶向两种或两种以上抗原的多靶点CAR-T或联合输注靶向不同抗原的CAR-T细胞或改造CAR-T细胞以增强scFv对其靶标的亲和力，使其能对较低水平的靶抗原作出反应。在CAR-T结构上引入自杀基因(如iCasp9)以通过半胱天冬氨酶途径诱导肿瘤细胞凋亡，增加靶向肿瘤毒性减少抗原逃逸。靶抗原可从细胞膜上裂解并释放到血液循环中形成可溶性蛋白抗原，由于降低肿瘤细胞表面的靶抗原密度和(或)阻断CAR的抗原结合域，可溶性蛋白抗原可能阻碍CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别。有研究发现暴露于γ-分泌酶抑制剂(GSIs)可有效阻断骨髓瘤细胞释放sBCMA。使BCMA CAR-T细胞具有更高的抗肿瘤能力[42]。

5 结语与展望

CAR-T细胞疗法是MM极具前景的新治疗方法之一，多个国家、地区的研究者们针对其不同靶点进行了大量临床前研究及临床研究，证明了CAR-T具有较好的疗效和缓解率，但CAR-T治疗的不良反应如CRS、神经系统事件同样不容忽视，抗原下调、免疫逃逸等原因造成CAR-T治疗的缓解持续时间有限，甚至复发，通过多靶点CAR-T，化疗、单抗联合CAR-T等方式可以减少抗原逃逸，增加疗效。此外，自体CAR-T产品还有制作步骤复杂、制作周期较长、价格高昂等问题，在等待CAR-T治疗过程中患者随时可能疾病进展，使用健康供者的T细胞制作通用型CAR-T，可减少患者的等待时间。目前已有CAR-T产品上市用于多发性骨髓瘤的治疗，相信CAR-T未来能在多发性骨髓瘤的临床治疗中发挥更大的作用。