血清微小核糖核酸-4286与幽门螺旋杆菌感染的子痫前期患者妊娠结局的关系

于 艳，白青山，才蔚涛，高 慧

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期高血压加重的表现之一，可导致胎儿宫内窘迫、死亡、溶血、肝酶升高及血小板减少 （hemolysis,elevated liver enzymes and low platelets，HELLP）综合征及心力衰竭等，严重威胁着母婴的生命安全[1]。有研究[2，3]表明，幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp）可诱发炎症及脂代谢紊乱，破坏血管内皮功能，并通过该方式参与PE发病。临床中应密切关注PE患者，避免不良妊娠事件发生，尤其是Hp感染的PE患者。探究预示Hp感染的PE患者妊娠结局的生物标志物，及时给予干预，可避免不良妊娠事件发生。

既往有多数微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）参与了PE发病和进展过程，如miR-30-5p[4]和miR-195[5]等。miR-4286作为miRNAs家族中一员，被报道可靶向转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）/Smad家族成员3（Smad3）抑制细胞凋亡和炎症反应，改善血管内皮细胞损伤[6]。TGF-β1/Smad3通路参与了PE发病和进展过程[7]，此外血管内皮细胞损伤亦与PE密切相关。基于此，有理由推测miR-4286与PE有关，或可用于预判PE妊娠结局。目前，鲜有研究分析miR-4286与PE及其妊娠结局的关系。笔者研究选取Hp感染的PE患者作为研究对象，分析miR-4286与PE及其妊娠结局的关系，以期为PE妊娠结局的预判提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 临床材料

选择2019年1月至2020年5月唐山市妇幼保健院的204例Hp感染的PE患者（Hp+PE组），年龄24～40岁，平均年龄31.87岁（标准差3.68岁）；孕前体质量指数（body mass index，BMI）21.01～31.55 kg/m2，平均孕前BMI 25.69 kg/m2（标准差2.42 kg/m2）；辅助生殖27例（13.24%）。选择同期的89例Hp感染的孕妇（Hp组），年龄24～40岁，平均年龄31.67岁（标准差3.89岁）；孕前BMI 21.30～31.55 kg/m2，平均孕前BMI 25.47 kg/m2（标准差2.49 kg/m2）；辅助生殖14例（15.73%）。该研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，经唐山市妇幼保健院医学伦理委员会批准（伦理编号：2019-015-001）。

选择标准：①Hp感染依据13C-尿素呼气试验检查结果；②PE诊断依据《妇产科学（第9版）》[8]中相关标准；③首次妊娠，且为单胎；④于妊娠28周前发病；⑤接受降压治疗；⑥签署了知情同意书。

排除标准：①既往有冠心病史、精神疾病史、血液系统疾病史及恶性肿瘤史等；②肝肾功能严重异常；③有高血压家族史或子痫家族史；④随访资料不完整。

Hp组与Hp+PE组年龄、孕前BMI和辅助生殖占比比较，差异均无统计学意义（t/χ2=0.417、0.680、0.321，P=0.677、0.497、0.571）。

1.1.2 主要试剂与仪器

Takara 9108 RNAiso Plus 9108 trizol RNA提取试剂和6011A PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA公司，日本）；miR-4286和内参U6引物（上海吉玛制药技术有限公司，中国）。

TDL5M型低温离心机（杭州川一实验仪器有限公司，中国）；752型紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司，中国）；9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（ABI公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-4286水平检测

用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）法检测血清miR-4286水平。抽取患者PE确诊时（T1）、妊娠28周第1天（T2）和妊娠30周第1天（T3）的肘部静脉血10 mL，于4℃3 000×g条件下离心5 min，提取上层血清；用trizol RNA提取试剂提取总RNA（OD260/280在1.9～2.0），用cDNA Synthesis Kit将RNA逆转录为cDNA，用PCR仪扩增cDNA，反应条件95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃扩增30 s，40个循环[9]。miR-4286上游序列：5＇-ACCCCACUCCUGGUACC-3＇，下游序列：5＇-TACCAGGAGTGGGGTTT-3＇；U6上游序列：5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游序列：5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。用2-ΔΔct法计算miR-4286的相对水平。

1.2.2 随访及分组

随访Hp+PE组患者至孕妇生产，记录其妊娠结局。参照文献[10]，将随访过程中Ⅲ度（羊水呈棕黄色，稠厚）及以上羊水污染、胎儿宫内窘迫、胎儿死亡、进展为子痫、并发HELLP综合征、肺水肿或心力衰竭定义为不良妊娠结局。

根据随访过程中是否发生不良妊娠结局将Hp+PE组患者分为结局不良组和结局良好组。

1.2.3 观察指标

（1）比较Hp组与Hp+PE组T2、T3时点miR-4286水平。

（2）比较结局不良组与结局良好组临床资料（年龄、孕前BMI、辅助生殖、PE发病孕周、血压、24 h尿蛋白、剖宫产、分娩孕周），用重复测量方差比较两组T1、T2和T3时点的miR-4286水平。

（3）用受试者工作特性（receiver operating characteristics，ROC）曲线评价不同时间点的miR-4286对妊娠结局不良的诊断价值。

（4）用Logistic回归分析miR-4286与Hp+PE妊娠结局的关系。

1.3 统计学方法

用R软件（4.1.0版，https://cran.r-project.org）进行统计分析。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较用独立样本t检验；组内两两比较用配对样本t检验。非正态分布的计量资料用中位数和四分位数间距[M（QR）]表示，两组间比较用Mann-Whitney U检验。计数资料用例（%）表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp组与Hp+PE组miR-4286水平比较

Hp组T2和T3时点miR-4286水平均高于Hp+PE组，差异有统计学意义（t=2.987，P=0.003；t=8.891，P=0.000）；Hp组和Hp+PE组T3时点miR-4286水平均高于T2时 点（t=6.558，P=0.000；t=3.516，P=0.001），Hp组miR-4286水 平 升 高 程 度[0.38（0.56）]高于Hp+PE组[0.06（0.57）]，差异有统计学意义（Z=4.156，P=0.000）。见表1。

表1 Hp组与Hp+PE组miR-4286水平比较Tab.1 Comparison of miR-4286 levels between Hp group and Hp+PE group

2.2 Hp+PE患者妊娠结局及分组情况

随访204例Hp+PE组患者，其中27例失联，随访率为86.76%。Hp+PE组中有121例（59.31%）妊娠结局不良，其中Ⅲ度及以上羊水污染58例，胎儿宫内窘迫34例，胎儿死亡4例，进展为子痫9例，并发HELLP综合征6例，肺水肿4例，心力衰竭6例。

根据随访过程中是否发生不良妊娠结局将Hp+PE组患者分为结局不良组（n=121）和结局良好组（n=83）。

2.3 结局不良组与结局良好组的临床资料比较

结局不良组与结局良好组年龄、孕前BMI、辅助生殖占比和PE发病孕周差异均无统计学意义（P＞0.05）。结局不良组确诊时收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）、24 h尿蛋白和剖宫产占比均高于结局良好组，分娩孕周低于结局良好组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 结局良好组与结局不良组临床资料比较Tab.2 Comparison of clinical data between 2 groups

2.4 结局不良组与结局良好组miR-4286水平比较

两组miR-4286水平比较，差异有显著统计学意义（F=99.072，P=0.000），即结局不良组T1、T2和T3时点miR-4286水均低于结局良好组（t=10.045、4.745、4.074，P=0.000、0.000、0.000）；两组miR-4286水平存在时间差异（F=141.800，P=0.000），即两组miR-4286水平随时间进展均呈升高趋势；miR-4286水平存在时间和组间的交互效应（F=3.590，P=0.031），即结局不良组miR-4286水平升高程度[0.45（0.52）]高于结局良好组[0.32（0.45）]（Z=2.198，P=0.028）。见表3。

表3 结局良好组与结局不良组miR-4286水平比较Tab.3 Comparison of miR-4286 levels between 2 good outcome group and poor outcome group

2.5 不同时间点miR-4286对妊娠结局不良诊断价值分析

T1时点的miR-4286判断妊娠结局不良的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）高于T2和T3时点miR-4286，差异均有显著统计学意义（Z=3.677、4.177，P=0.000、0.000）。T2时点miR-4286判断妊娠结局不良的ROC AUC略高于T3时点miR-4286，但差异无统计学意义（Z=0.260，P=0.795）。见表4和图1。

表4 miR-4286判断妊娠结局不良的价值Tab.4 Value of miR-4286 in diagnosis of poor pregnancy outcomes

图1 miR-4286判断妊娠结局不良的ROC曲线Fig.1 ROC curve of miR-4286 in diagnosis of poor pregnancy outcome

2.6 miR-4286与Hp+PE妊娠结局的关系

分别以204例患者的SBP、DBP、24 h尿蛋白、分娩孕周和T1时点miR-4286水平中位数为界值将其转换为二分类变量，变量赋值见表5。将妊娠结局作为因变量，将SBP、DBP、24 h尿蛋白、分娩孕周、剖宫产和T1时点miR-4286水平作为自变量，纳入多因素Logistic回归分析，结果显示SBP＞154 mmHg、24 h尿蛋白＞2.37 g和剖宫产是Hp+PE患者妊娠结局不良的独立危险因素（P＜0.05），分娩孕周＞37周和T1时点miR-4286水平＞1.47是Hp+PE患者妊娠结局不良的独立保护因素（P＜0.05）。见表6。

表5 变量赋值Tab.5 Variable assignment

表6 Hp+PE患者妊娠结局的Logistic回归分析结果Tab.6 Logistic regression analysis results of pregnancy outcomes of Hp+PE patient

3 讨论

目前，临床尚无有效手段治疗PE，为避免不良妊娠相关疾病发生，唯一的方法就是终止妊娠。终止妊娠的时间选取至关重要，过早或过度延长妊娠时间均会导致妊娠结局不良；此外，过度延长妊娠时间还会导致各种并发症[10]。探寻准确预判PE妊娠结局的指标有着重要意义，其对治疗方案的制定有着决定性作用。

miR-4286可通过调节细胞凋亡和炎症反应参与血管内皮损伤过程[6]，其可能通过以下机制参与了PE发病。PE发病机制包括氧化应激、母胎免疫平衡失调及滋养细胞浸润异常等[11]。孕妇胎盘浅着床会导致胎盘血流灌注相对不足，血管内皮生成因子的分泌会减少，同时还会刺激机体分泌更多的抗血管生成因子，如可溶性FMS样酪氨酸激酶-1、可溶内皮糖蛋白等，促进活性氧生成和缺氧诱导因子-1等炎性细胞因子分泌，诱发内皮功能障碍，最终导致PE发病[12]。笔者研究比较了Hp组和Hp+PE组T2和T3时点miR-4286水平，结果显示Hp组T2和T3时点miR-4286水平均高于Hp+PE组，该结果提示miR-4286水平与PE发病有关。此外，研究结果还显示两组miR-4286水平随时间进展均呈升高趋势，但Hp组miR-4286水平升高程度高于Hp+PE组，该结果亦提示miR-4286水平与PE发病有关，或许与妊娠结局有着一定联系。

笔者研究比较了不同妊娠结局患者的miR-4286水平，结果显示结局不良组T1、T2和T3时点miR-4286水平均低于结局良好组，该结果提示miR-4286水平与Hp+PE妊娠结局有关；两组的miR-4286水平随时间进展呈升高趋势，结局不良组miR-4286水平升高程度高于结局良好组，该结果进一步佐证了miR-4286水平与Hp+PE妊娠结局有关，检测其水平或可有助于妊娠结局的判断。遂比较了T1、T2和T3时点miR-4286水平判断妊娠结局不良的价值，结果显示T1时点miR-4286水平判断妊娠结局不良的ROC AUC为0.864，高于T2和T3时点miR-4286，该结果提示T1时点miR-4286水平判断妊娠结局不良的价值较高，遂将其纳入Logistic回归分析。

进一步通过Logistic回归分析miR-4286与妊娠结局的关系，结果显示T1时点miR-4286水平＞1.47是Hp+PE患者妊娠结局不良的独立保护因素。miR-4286通过TGF-β1/Smad3通路抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐带血管内皮细胞凋亡和炎症反应，改善血管内皮细胞损伤[6]。TGF-β1/Smad3通路及血管内皮细胞损伤均参与了PE发病和进展过程，TGF-β1/Smad3通路的激活不仅与血管内皮的损伤有关[6]，还会增强人绒毛膜滋养层细胞的生长、增殖及迁移侵袭能力[7，13]，血管内皮的损伤会引起多系统器官的受损，严重威胁着母胎生命安全[14]。miR-4286与妊娠结局有关，推测其原因是其可调节TGF-β1/Smad3通路或血管内皮损伤参与PE进展，其水平与患者血管内皮损伤有关，进而反映妊娠结局。麦彩园等[15]研究显示PE孕妇24 h尿蛋白定量较高与母婴不良妊娠结局的发生有关，吴立英[16]研究显示妊娠期高血压和剖宫产是不良妊娠结局发生的独立危险因素。笔者研究结果显示SBP＞154 mmHg、24 h尿蛋白＞2.37 g和剖宫产是Hp+PE患者妊娠结局不良的独立危险因素，与上述研究结果一致。此外，研究结果还显示分娩孕周＞37周是Hp+PE患者妊娠结局不良的独立保护因素。分娩孕周＞37周表示胎儿属于足月产，其不良事件，如胎儿宫内窘迫、胎儿死亡等的发生率低于早产儿。

综上所述，PE确诊时miR-4286水平＞1.47与Hp+PE患者妊娠结局良好有关。笔者研究仅比较了PE确诊、妊娠28周第1天和妊娠30周第1天 时miR-4286水平与妊娠结局的关系，下一步将增加时间梯度，分析各时点指标的价值；此外，对于miR-4286水平是否可用于孕周28周后PE发病或未感染Hp的PE患者妊娠结局的判断，还未可知，下一步将针对上述不足，进行补充，充实研究内容。