骨肉瘤组织CD74的表达及其与患者预后的关系

张雅文， 梁金容， 胡海燕，周 琰，孙元珏，王 琼

1)安徽理工大学医学院 安徽淮南 232001 2)上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科 上海 200233

骨肉瘤是最常见的骨原发恶性肿瘤,起源于间叶组织，发病率为3/100万[1-2]，因其起病隐匿且局部侵袭性和远处转移能力较强，绝大多数患者确诊时就已发现转移[3-4]。近年来，肿瘤免疫治疗已被列为继手术、化疗、放疗后的第四大治疗模式。随着免疫检查点抑制剂的发现，肿瘤的免疫治疗取得了重大突破[5]。CD74是一种Ⅱ型跨膜蛋白，在免疫应答中以分子伴侣的形式与主要组织相容性复合体Ⅱ型蛋白结合，参与免疫系统的抗原呈递、B细胞分化和炎症信号传导等关键过程[6]。CD74在一些恶性肿瘤组织表达增高，并与预后相关。胃癌组织CD74的表达与肿瘤的浸润深度和临床分期呈负相关[7]。肿瘤分化越差、临床分期越高的结肠腺癌组织CD74的阳性表达率越高，CD74阳性的结肠腺癌预后差[8]。关于膀胱尿路上皮癌组织CD74表达的研究[9]也发现了类似的结果。本研究运用单细胞转录组测序技术检测CD74在不同骨肉瘤病灶组织中的表达，并且通过对不同临床病理特征和预后的骨肉瘤患者原发病灶组织中CD74表达情况进行分析，进一步为骨肉瘤的诊断和治疗提供更多的生物学参考指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象单细胞转录组测序样本：收集2017年10月至2019年4月于上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科住院的11例骨肉瘤患者(男5例和女6例，年龄11～38岁)手术切除的骨肉瘤新鲜组织，其中原发病灶7例、复发病灶2例、肺转移病灶2例。组织芯片样本：收集2018年12月至2020年4月上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科收治的骨肉瘤患者手术切除的骨肉瘤原发病灶组织标本90例，制备成组织芯片，其中7例组织脱落，共纳入83例。83例骨肉瘤患者中男49例，女34例，年龄5～56岁;肿瘤直径≤5 cm 39例，>5 cm 44例;Enneking分期Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ期55例；病理类型普通型为69例，非普通型为14例；肿瘤坏死率≤90% 40例，>90% 43例。所有患者均获随访，患者的生存时间定义为初次诊断至2020年4月最后1次随访或死亡。

1.2 主要试剂与仪器Gexscopetm组织保存液、解离液、红细胞裂解液和单细胞文库制备系统(南京新格元生物科技有限公司)。Chromium单细胞基因表达检测试剂盒、Gel Bead及Multiplex试剂盒和ChromiumTM单细胞分析测试平台(美国10X Genomics公司)，NextEra XT DNA试剂盒(美国Illumina公司)，高灵敏度DNA试剂盒(美国Agilent Technologies公司)。CD74兔单克隆抗体(美国Abcam公司)，山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色试剂盒(福州迈新生物科技有限公司)。组织芯片制作机(武汉塞维尔生物科技公司)。

1.3 骨肉瘤组织单细胞CD74 mRNA的检测

1.3.1单细胞样本制备和转录组文库建立 取新鲜肿瘤组织保存于Gexscopetm组织保存液中，术后30 min内冰冻处理，用Hank′s平衡盐溶液清洗3次，切成厚1～2 mm的碎片，加入2 mL Gexscopetm组织解离液，持续搅拌15 min。40 μm无菌滤网过滤后800×g离心5 min，弃上清，将细胞颗粒悬浮在1 mL PBS中。加入2 mL Gexscopetm红细胞裂解液，25 ℃孵育10 min，500×g离心5 min，弃上清，将细胞悬浮于PBS中。台盼蓝染色，相差显微镜下评价细胞活性，细胞活性大于95%方可继续实验。使用单细胞文库制备系统将单个细胞包裹成乳液滴。使用Gel Bead及Multipex试剂盒构建单细胞RNA测序文库。光学显微镜检查细胞，并用血细胞计数仪计数。在每个通道中加载细胞，目标输出为5 000个细胞。在ChromiumTM控制器中，细胞被分割成凝胶珠后进行细胞裂解和RNA反转录。用NextEra XT DNA试剂盒扩增出的cDNA构建测序文库，并在Agilent生物分析仪上使用高灵敏度DNA试剂盒对最终文库进行评估。

1.3.2单细胞转录组测序 在Illumina HiSeq X平台上，用75个循环运行试剂盒汇集单个文库进行测序，并进行150 bp的成对末端阅读,具体分析方法参照文献[10]。基于Harmony与Louvain算法，将测序数据植入Seurat包的“FindClusters”函数后，采用t分布随机邻居嵌入(tdistribution-stochastic neighbor embedding,t-SNE)方法在二维图上显示识别出的聚类，阈值设定为5，颜色越深，表达程度越高。

1.4 骨肉瘤组织CD74蛋白表达的检测

1.4.1组织芯片制备 根据HE染色观察结果对待测石蜡组织标本中有代表性的点进行标记。取97.5 g莱卡石蜡和2.5 g蜂蜡混合，制成长36 mm、宽26 mm、高17 mm的空白蜡块；在该蜡块20 mm×16 mm范围内设计8×12点组织陈列，用组织仪打孔制成组织芯片蜡块，在组织芯片制作机上用细针对受体蜡块打孔(直径1 mm)，同样在供体蜡块上标记的相应部位打孔(直径1 mm)采集组织芯；将组织芯转移到受体模块的孔中，每个组织芯之间的间距为0.2 mm。将构建好的组织芯片蜡块放在相宜的塑料盒子内，置55 ℃温箱中约10 min，在蜡块将要完全熔解前取出，室温下冷却，使受体模块蜡与新插入的小圆柱状组织融为一体，冰冻切片机切片。

1.4.2免疫组化检测与结果评定 将组织芯片脱蜡至水，体积分数3%的H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，山羊血清封闭，室温孵育10 min；倾去血清，滴加CD74特异性一抗(1∶100)4 ℃过夜孵育，PBS冲洗3次；滴加山羊抗兔二抗(1∶500)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；滴加第2代辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30 min。PBS冲洗；DAB显色，自来水充分冲洗；苏木精复染；纯乙醇脱水1 min，晾干，二甲苯透明10 min，晾干，中性树胶封片。使用组织切片数字扫描仪采集图像，利用赛维尔图像分析系统自动读取。染色强度：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。细胞阳性表达率评分：0～为0分，6%～为1分，26%～为2分，51%～为3分，>75%为4分。综合评分为染色强度×细胞阳性表达率，0分为阴性，1～分为弱阳性，5～分为阳性，9～12分为强阳性；>6分为CD47蛋白高表达，≤6分为低表达。

1.5 统计学处理采用SPSS 24.0进行数据分析。应用χ2检验分析不同性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、Enneking分期以及复发等临床病理特征患者骨肉瘤组织CD74蛋白表达强度的差异；应用COX回归分析骨肉瘤患者预后的影响因素；生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，生存分析采用Log-rank检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同骨肉瘤组织单细胞CD74 mRNA的表达骨肉瘤原发病灶组织CD74 mRNA的表达高于肺转移病灶和复发病灶，见图1。

A:原发病灶;B:肺转移病灶;C:复发病灶

2.2 骨肉瘤组织CD74蛋白的表达83例骨肉瘤组织分为CD74蛋白低表达37例和高表达46例(图2)。两组骨肉瘤患者临床病理特征分析见表1，年龄、Enneking分期和有无肺转移与CD74蛋白的表达有关。

2.3 生存分析83例患者中23例因死亡而终止随访。CD74蛋白高表达组患者平均生存期为(26.15±1.80)个月，3 a生存率为50.00%；CD74蛋白低表达组平均生存期为(33.30±1.23)个月，3 a生存率为81.08%，CD74蛋白高表达组患者的生存情况差于低表达组(χ2=12.480，P<0.001),见图3。

A：CD74蛋白低表达组；B：CD74蛋白高表达组

表1 不同临床病理特征患者骨肉瘤组织中CD74蛋白表达的比较 例(%)

图3 CD74蛋白高表达组与低表达组骨肉瘤患者生存曲线

2.4 骨肉瘤患者预后的危险因素分析COX回归分析结果(表2)显示有肺转移和CD74高表达是骨肉瘤患者预后的危险因素。

表2 骨肉瘤患者预后影响因素的COX回归分析结果

3 讨论

骨肉瘤是最常见的骨肿瘤，也是人类异质性最高的实体肿瘤之一，这种异质性不仅发生在宏观层面，还发生在基因组、转录和表观遗传水平上。单细胞转录组测序在探索肿瘤内异质性以及细胞与肿瘤微环境的相互作用方面显示出很好的应用价值[11]。作者前期应用单细胞转录组测序技术获得了11例骨肉瘤病灶组织单细胞转录组数据[10]，通过t-SNE分析和细胞的无偏聚类平行识别出骨肉瘤的11个主要细胞簇，CD74在4个主要细胞簇中呈高表达。本研究结果显示原发病灶中的CD74 mRNA表达程度最高，因此后续实验选用骨肉瘤原发病灶组织标本。

既往研究[8]发现CD74在结肠癌中表达增高，且CD74表达阳性的患者预后较差。此外，CD74在其他恶性肿瘤如胃癌[7]、非小细胞肺癌[12]和胶质瘤[13]中都高表达，且都与不良的预后相关。本研究结果显示CD74蛋白高表达组预后差于低表达组，提示CD74蛋白的表达与患者预后相关，与以上研究结果一致。本研究结果显示CD74蛋白高表达组患者Enneking分期Ⅲ期和有肺转移多见，提示CD74可能促进骨肉瘤的远处转移；COX回归分析结果显示有肺转移和CD74蛋白高表达是骨肉瘤患者预后的危险因素，提示CD74可作为预测骨肉瘤患者预后的潜在指标。

综上所述，作者发现CD74可能与骨肉瘤患者不良预后有关，其作用机制有待进一步分子水平上的研究。