酱油发酵过程中生物胺生成影响因素及其调控研究进展

刘威，董浩，曾晓房，白卫东，于立梅*

(1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广州 510225；2.广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广州 510225；3.农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，广州 510225)

酱油是起源于我国的一种传统发酵调味品，在日常烹饪中发挥着调味、调色、增鲜、增香的重要作用。酱油是利用发酵微生物将高蛋白质的植物性原料(豆类，以黄豆为主)分解为众多的氨基酸、有机酸等物质，再经过复杂的化学反应和各类代谢途径形成的具有丰富营养物质和独特风味的调味液。

由于微生物和非生物化学反应，酱油酿造过程中会出现氨基酸脱羧或醛转氨现象，产生不良化合物生物胺(biogenic amines， BAs)。BAs具有生物活性，与人体健康息息相关。摄入含有高浓度BAs的食物可能会对人体造成不良毒理学影响甚至产生癌细胞[1]。目前国内外学者对酱油的研究主要集中在酱油BAs的检测[2-4]、调控[5-6]以及品质[7]等方面。本文对BAs的产生机理、生成因素、调控方法进行系统的归纳总结，旨在为科学生产酱油、减少酱油中BAs的生成、调控等提供参考。

1 酱油中生物胺的形成机制

BAs是在食品长期发酵中产生的低分子量含氮有机化学物质。酱油发酵过程中蛋白质在曲霉等微生物的作用下被分解为游离氨基酸和小分子肽，同时代谢出氨基酸脱羧酶氨，使氨基酸发生脱羧反应，导致BAs的产生。因此，在BAs形成过程中，以下因素发挥作用：微生物——分泌促使氨基酸脱羧的酶；前体物质——原料中蛋白质被分解后的游离氨基酸；环境需求——满足微生物生长、脱羧酶活性以及脱羧反应的条件。生物胺的合成有两种途径：一是氨基酸的脱羧作用，包括丙酮酰基团脱羧机制和磷酸吡哆醛脱羧机制；二是酮和醛的转氨和胺化作用。

1.1 酱油中BAs种类

各种发酵酱油中BAs的类型和含量并不一致，其中酪胺是酱油中含量最丰富的BAs，酱油中常见的BAs见表1。按照不同的分类标准，BAs有不同的分类，BAs的分类见表2。BAs作为食品被吸收进人体后，不同的BAs发挥着不同的生理作用。

表1 酱油中8种生物胺基本信息Table 1 Basic information of eight biogenic amines in soy sauce

表2 生物胺的分类Table 2 Classification of biogenic amines

1.2 酱油中产生BAs的微生物

动植物原料的使用是食品含有一部分BAs的原因，而微生物的合成作用则是BAs来源的重要原因。酱油的酿造就是微生物将固态蛋白质原料转变为液态调味料的一个过程，微生物的存在决定酱油的形成。霉菌、细菌和酵母菌与BAs形成密切相关，但是并非所有微生物都能促进BAs的形成，大部分微生物缺乏分泌氨基酸脱羧酶的能力。李巧玉[8]对高盐稀态酱油酱醪中的魏斯氏菌进行分离，得到3种菌——融合魏斯氏菌、类肠膜魏斯氏菌和食窦魏斯氏菌，发现大部分魏斯氏菌缺乏合成BAs的能力，仅仅个别类肠膜魏斯氏菌能够产生多种BAs。日本学者Ibe发现组胺是由Lactobacillussp.产生的，而酪胺是由Enterococcusfaecium产生的，产生酪氨的菌株是一种革兰氏阳性球菌，并被鉴定为肠球菌[9-10]。Li等[11]的研究结果表明，BAs产生的关键在酱油制曲和发酵阶段。在酱油前期发酵有赖于霉菌，在酱油发酵后期得益于乳酸菌和酵母菌。微生物菌种由于所产生的脱羧酶种类、数量、质量的差异，最终造成BAs的差异。在发酵过程中微生物菌群的变化也牵动着生物胺的变化，两者相互关联、密不可分。

2 影响生物胺形成的因素

2.1 原料

原料是影响BAs形成的一个基本因素。原料产地、种类、数量、质量等方面存在差异，为酱油中BAs的差异创造了条件。原料对BAs形成的影响主要包括以下几个方面：第一，原料本身存在BAs，作为底物和反应的场所，参与其生成。Nout等[12]明确了原料中大豆的种类和比例影响发酵豆制品中BAs的含量。曹忠娜[13]发现，与豆粕相比，黄豆可减少BAs的生成；第二，不同的原料因其营养构成不同，适合不同的菌群生存，形成不同的微生物群体，最终形成不同的BAs；第三，具有氨基酸脱羧酶活性的假单胞菌、肠球菌、肠杆菌等细菌会污染处理前的原料，增加BAs生成几率。在发酵过程中，在这些细菌死亡后仍伴随氨基酸脱羧酶活性，从而无法阻止BAs在发酵食品生产、贮存过程中的不断累积[14]。因此，对酿造酱油的原料进行加工工艺和卫生管理把控，实行危害分析与关键控制点(HACCP)有利于降低BAs，减少BAs的生成。

2.2 盐含量

食盐对BAs的形成有双重效果：一方面，食盐的高渗透压能阻碍产胺微生物的生长、繁殖；另一方面，影响细菌细胞膜上氨基酸脱羧酶的活性，导致其脱羧能力下降，从而降低发酵制品中BAs的积累。Kim等[15]发现随着食盐浓度的增加，BAs的含量随之减少。也有研究发现，高盐稀态酱油中将盐含量提高至20%，可有效降低BAs的产生。但为了保证传统酱油正常的咸度和风味，一般将盐含量控制在16%～18%。其次，并不是盐含量越高，BAs的含量就越低，两者也不是负相关关系。因为在高盐浓度下耐盐微生物的氨基酸脱羧酶活性反而得以增强，有利于BAs的增加。盐对于BAs产生促进作用还是抑制作用，取决于菌种对盐的耐受程度。袁树昆[16]采用较高盐浓度生产鱼酱油，发现细菌群落与低盐度相比没有明显差异，优势菌属没有明显的变化。刘蕊[17]应用新型低盐固态发酵工艺酿造酱油，减少了发酵使用盐量，发现发酵组的8种BAs总量均不超过250 mg/mL,保证了酱油的品质安全。因此，盐度的高低对于BAs含量的影响也是复杂的。

2.3 pH

pH是微生物生长和氨基酸脱羧酶活性的关键因素。有报道表明，pH值在3.0～6.0范围内细菌最适宜产生脱羧酶[18]，脱羧酶活力在pH 为4.0～5.5之间最高。pH的降低一方面抑制微生物的生长，降低BAs的生成；另一方面增加氨基酸脱羧酶的生成量和增强其活性，促进BAs形成[19]。原因在于，在低pH环境下，为了抵抗外部酸度环境，细菌产生更多的BAs。在酱油初始发酵阶段，发酵液的pH约为6.5，耐酸微生物占优势，代谢能力增强，氨基酸脱羧酶活性提升，促使大量游离氨基酸释放出来，为BAs的形成提供了条件[20]。因此，在pH影响下，微生物与脱羧酶相互作用贯穿酱油整个发酵过程，最终决定BAs的含量。

2.4 温度

温度对酱油中微生代谢物和酶活性都有影响。大部分微生物、蛋白水解酶以及氨基酸脱羧酶在低温(≤5 ℃)或高温(≥40 ℃)条件下都难以正常活动，因此BAs的合成受到影响；而在20～37 ℃温度条件下则有利于BAs的积累。 Eleonora等[21]发现在30～37 ℃酪氨酸脱羧酶脱羧力度最强。目前酿造酱油的两种发酵方式中，低盐固态酿造采取的发酵温度≥35 ℃，而高盐稀态酿造选择的发酵温度一般在28～30 ℃之间。研究表明，高温条件有利于增加BAs的生成[22]。目前酱油的酿造主要采取高盐稀态发酵方式，如何在保证酱油风味和品质的前提下，致力于低温发酵酱油生产和改善低盐固态发酵中存在的问题是未来酱油研发的方向。

3 酱油中生物胺的调控措施

根据影响BAs形成的途径可以从游离氨基酸、微生物、氨基酸脱羧酶活性以及降解菌4个方面对BAs进行控制。

3.1 控制酱油中游离氨基酸的含量

游离氨基酸是BAs的来源之一，也是重要的限制因子。游离氨基酸被氨基酸脱羧酶作用发生脱羧反应产生BAs。某种程度上，BAs的种类和数量取决于游离氨基酸的种类和含量，两者呈正相关[23]。游离氨基酸是反应的前体物质，减少游离氨基酸含量能够达到降低BAs合成量的结果。Wang等[24]研究表明，在一定范围内提高温度，适当降低盐含量有利于促进蛋白酶的水解活性，加快了对蛋白质的分解，推动了游离氨基酸的累积，利于生物胺的生成。但是氨基酸的种类、数量和原料的蛋白质含量反映了酱油的风味、营养品质等关键指标，为了限制BAs的生成而控制游离氨基酸和蛋白质含量的措施缺乏可行性。López-Rituerto等[25]发现葡萄酒发酵中利用酵母可实现由组氨酸到组氨醇的转变，Yerlikaya等[26]研究发现谷氨酰转胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)能够使蛋白质之间的氨基酸结合，从而无法被氨基酸脱羧酶利用。因此，对游离氨基酸的转化过程施加影响，形成新的结合物，可为调控BAs合成开发一个新路径。

3.2 调控酱油中的微生物

微生物是BAs形成的前提条件之一，缺乏产氨基酸脱羧酶微生物的参与，食物中的游离氨基酸无法形成BAs。因此，通过控制原有的产氨基酸脱羧酶微生物生长代谢活性而降低食品中BAs的含量，是目前控制BAs含量非常有效的方法。另外，改变微生物中的菌群种类、比例、数量，或者引进另外的微生物对于抑制BAs的生成也能够起到非常好的效果。

Guo等[27]通过对不同耐渗透酵母菌株的联合接种发现，Z.rouxiiCICC 1417和T.candidaCICC 1019联合接种的BAs含量最低(89.43 mg/L)。Mohamed等[28]利用宏基因组学和宏转录组学研究在酱油发酵过程中香菜对微生物菌群和BAs的影响，发现酱油发酵过程中加入香菜改变了微生物菌群的组成，有效抑制了BAs的生成。Qi等[29]研究广东酱油发酵过程中微生物群落对BAs含量的影响，发现接种QH-17和嗜盐杆菌CGMCC 3792，苯乙胺、酪胺、组胺含量均显著降低。Kim等[30]发现在韩国酱油(Cheonggukjang)发酵中蜡样芽孢杆菌具备产胺能力，加入地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)使该菌株的含量从3～4 lg CFU/g降低到1 lg CFU/g以下，并且有效地降低了BAs的含量。由此可见，在酱油原本微生物体系中引入外源微生物，作为新型发酵剂，对原本产胺微生物菌株产生拮抗作用，可降低BAs的生成累积。这些结果表明，生物干扰是酱油发酵过程中减少和消除BAs的有效策略。

3.3 控制酱油中氨基酸脱羧酶活力

氨基酸脱羧酶是一类裂解酶，对氨基酸进行催化裂解使其脱去羧基，形成对应的胺。通过调节pH、含盐量、温度等因素可以控制氨基酸脱羧酶的活力。邹阳等在酱油制曲时添加冰醋酸，成功地降低了酱油中精胺、亚精胺及组胺的含量。Liu等利用高效液相色谱(HPLC技术)，证明了盐度在高盐稀态酱油发酵中对降低BAs具有关键作用。pH、盐度、温度等与酱油中BAs的含量并不是单一的线性关系，它们属于酱油本身的某种特性，改变这些因素将对酱油的品质和风味造成影响。因此，采用单一调节某一个因素的方法抑制酶活性的措施并未得到广泛的应用。目前，更多的研究通过优化组合来控制氨基酸脱羧酶活力，达到调控BAs生成的目的。曹忠娜等在高盐稀态酱油制作过程中，既将发酵温度降低到约20 ℃，又将盐的含量提高到20%，有效降低了BAs生成总量。Li等研究得出在原料(DSW)、制曲环境(密封曲机)、发酵温度(38 ℃)、氯化钠(19%)、发酵时间(40 d)的条件下酿造的酱油的BAs得到有效抑制，同时特征营养素没有丢失。另外，Qiu等[31]研究豆腐乳在成熟过程中，添加乙醇的豆腐乳总BAs含量明显降低，推测乙醇对BAs的抑制作用机制可能是乙醇抑制了豆腐乳中脱羧酶活性。

3.4 提升酱油中BAs的降解水平

除了在源头上阻止BAs的生成外，降解已经存在的目标产物的BAs也是一个有效的调控方法。生物胺氧化酶(amine oxidases，AOs)由BAs降解菌株合成，能够将BAs分解成相应的乙醛(acetaldehyde)、氨和过氧化氢(H2O2)。微生物菌株除了能产胺氧化酶，还必须保证不具有产氨基酸脱羧酶活性，只有满足这两个条件才能用来降解食品中的BAs。程淑敏等[32]将BAs降解菌Wickerhamomycesanomalus和Millerozymafarinosa作为发酵剂接种至酱油发酵醪中，结果表明BAs被得到有效的降解。杨明泉等[33]将从酱醪中筛选获得的一株嗜盐片球菌扩大培养后，添加到以高盐稀态工艺酿造的酱油的酱醪中，结果发现酪胺含量下降了77.00%，色胺含量下降了100%。符姜燕等[34]证实了从低生物胺酱醪中筛选出的一株嗜盐四联球菌在正常生长发育过程中无法产生BAs。张雁凌等[35]在低盐酱油发酵过程中添加嗜盐四联球菌 TS71和鲁氏酵母A22，发现低盐酱油的BAs降低了3.42 mg/kg。Cheng等[36]从一些自然发酵食品样品中分离出异常威氏镰刀菌和法氏镰刀菌。在一定条件下该菌株表现出较高的多重BAs降解活性。蓝翔等[37]将两株BAs降解菌EnterococcusfaeciumR7和MillerozymafarinoseA3接种到发酵鱼露中，发现接种复合降解菌的降解能力强，生物胺降解菌的联合接种为抑制BAs合成提供了一个新路径。

4 总结

酱油是中国的传统调味品，但是酱油中的BAs存在超标的情况，因此对酿造酱油中BAs的形成机理以及调控方法进行研究对于提升酱油的品质，保证民众的健康显得尤为重要。了解BAs在酱油中的生成机理以及影响因素才能够深入挖掘抑制BAs形成的方法。在生物胺形成的过程中离不开微生物、酶活性、原料的成分、反应的环境等诸多因素的作用，由于这些因素在发酵过程中并不是独立作用的，而是相互影响，因此BAs的调控需要综合考虑，在实现酱油中BAs的有效降低和不损害酱油的品质中找到一个平衡点。