罗汉果美拉德反应制备食用香料的工艺优化

郝辉，王宣静，高明奇，陈芝飞，张弛，杨雯静，邢雨晴，黄家乐，许春平*

(1.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州 450016；2.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450001)

罗汉果又名拉汗果、假苦瓜，为多年生藤本落叶葫芦科植物罗汉果的干燥果实。罗汉果是卫生部首批公布的食药两用名贵佳品，其营养十分丰富，成熟的罗汉果含糖30%左右，其中有相当于约300倍蔗糖的甜苷，是蔗糖的最佳替代品，还含有蛋白质、油酸、亚油酸、多种氨基酸、D-甘露醇、锰、铁、镍、硒、锡、碘、钼等26种微量元素及维生素C等成分[1-2]。《广西中药志》记载:罗汉果“止咳清热，凉血润肠。治咳嗽，血燥胃热便秘等。”罗汉果具有调节血糖平衡、清热止咳、润肠通便、防癌、降血脂、美容养颜、抗氧化等功效，被广泛开发为食品、保健食品和药品[3-4]。

美拉德反应能赋予食品令人愉快的香味和诱人的色泽，是目前较为流行的一种香料生产技术，广泛应用于食品、医药等领域[5-6]。糖类在高温条件下熔融，经过一系列反应变为黑褐色物质的过程称为焦糖化作用。目前,焦糖的使用已遍及食品的各方面,市场前景广阔[7]。目前已有部分美拉德反应相关的文献报道，侯钰柯等[8]为提高鸡骨架利用率以及制备鸡肉风味基料，以鸡骨架酶解液为原料，通过单因素试验结合Friedman排序检验法和响应曲面优化结合模糊数学感官评价法，探究鸡骨架酶解液美拉德反应的最佳条件，用电子鼻和电子舌测定反应前后的气味和滋味，用高效液相色谱法测定氨基酸含量，气相-离子迁移谱法测定挥发性物质的含量并进行分析，研究结果可以为工业上研发高品质的肉味调味基料提供一定参考。喻世涛等[9]利用丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸与罗汉果浓缩液进行美拉德反应，并利用GC-MS技术对比分析反应产物中的挥发性成分，最终得出丝氨酸与罗汉果浓缩液的美拉德反应物中检出的挥发性成分种类更多，香气类型和香气强度也更符合使用要求。但是国内外还未出现关于天然植物罗汉果配以焦糖化料液结合美拉德反应制备香料的报道，本研究通过将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液进行掺配后进行美拉德反应制备罗汉果香料，研究加热温度、加热时间、体系初始pH、罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液的配比对罗汉果香料的影响，以感官评分为指标，优化得到最佳的反应条件，为天然植物罗汉果的开发应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗汉果：购自广西壮族自治区桂林市。

1.1.1 试剂

1 mol/L NaOH、二氯甲烷、无水乙醇：AR，天津市富宇化工有限公司；0.8211 mg/mL乙酸苯乙酯：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；食用葡萄糖：内蒙古阜丰生物科技有限公司；无水碳酸钠、无水硫酸钠：分析纯，天津大茂化学试剂厂。

1.1.2 仪器

Q-100A3高速多功能粉碎机 上海冰都电器有限公司；DGX-9143电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；TGL-16M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海湃澜仪器设备有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司；Ultra-3400紫外可见分光光度计 深圳市华伦康盛科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 罗汉果提取物的制备

参考陈敏等[10]的方法制备罗汉果提取物，具体步骤：将干罗汉果粉碎过20目筛，准确称取200 g罗汉果粉，加入4000 mL水，在60 ℃下搅拌6 h后离心，将滤渣加入2000 mL水，继续在60 ℃下搅拌2 h后离心，合并两次搅拌后的滤液，将滤液旋转蒸发得到罗汉果提取物52.54 g。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制备

参考朱远洋等[11]的方法制备葡萄糖焦糖化料液，具体步骤：准确称取100 g 无水葡萄糖，加入20%糖质量的无水碳酸钠作为反应助剂，加入250 mL水超声搅拌均匀后在160 ℃的油浴锅中加热30 min制备焦糖化料液。

1.2.3 掺配料进行美拉德反应单因素试验

反应时间、反应温度、反应pH等是美拉德反应生成特定风味的主要影响因素[12-13]，将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液按比例掺配，用1 mol/L的NaOH溶液调pH，将掺配料于油浴锅中进行加热催化美拉德反应。

1.2.3.1 反应时间的选择

将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例掺配，用1 mol/L的NaOH溶液调pH为6.0，反应温度设置为120 ℃，将掺配料于油浴锅中进行不同时间的美拉德反应，时间分别设置为20，40，60，80，100，120 min，优化最佳的反应时间。

1.2.3.2 反应温度的选择

将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例掺配，用1 mol/L的NaOH溶液调pH为6.0，反应时间设置为60 min，将掺配料于油浴锅中进行不同温度的美拉德反应，温度分别设置为80，100，120，140，160 ℃，优化最佳的反应温度。

1.2.3.3 反应pH的选择

将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液按3∶1的比例掺配，反应温度为140 ℃，反应时间为60 min，用1 mol/L的NaOH溶液调pH分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，将掺配料于油浴锅中进行美拉德反应，优化最佳的反应pH。

1.2.3.4 料液比的选择

将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液分别按5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1的比例掺配，反应温度为140 ℃，反应时间为60 min，反应pH为8.0，将掺配料于油浴锅中进行美拉德反应，优化最佳的反应配比。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，以反应时间、反应温度、初始pH、料液比4个因素为变量，以感官评分为指标[14-15]，设计四因素三水平L9(34)正交试验，确定罗汉果香料的最佳反应条件。正交试验因素和水平见表1。

表1 反应条件因素水平表Table 1 Factors and levels of reaction conditions

1.2.5 验证试验

对正交试验得到的最优水平组合进行试验，以验证结果的准确性。

1.2.6 感官评价

根据宋凌勇等[16]的方法，准确称取 1 g罗汉果提取物，用5 mL去离子水溶解，溶解后放置于密闭的磨口瓶中，感官评定小组由6名受过专业训练的感官评定员(3男3女)组成，通过嗅觉对待测样品的风味进行评分，从果香、甜香、烘烤香、药草香、膏香5个方面进行嗅香评价，每个方面最高分5分，最低分0分，嗅其挥发性香气，分辨其香气特色，评定其类型、风格及典型性的强弱程度，评价结果用雷达图表示。

1.2.7 褐变程度测定

用紫外可见分光光度计测定420 nm处的吸光度值表示美拉德反应产物的褐变程度，作为后期褐变聚合物类黑素形成的指标[17-18]。将各个反应样品稀释1000倍后测定其在420 nm处的吸光度，褐变度越大，美拉德反应终产物的积累量越大，反应越剧烈。

2 结果与分析

2.1 不同反应时间样品优化结果

不同反应时间的样品在波长420 nm处的吸光度值及感官评分结果见图1，嗅香雷达图见图2。

图1 反应时间对各个样品褐变及感官评分的影响Fig.1 Effect of reaction time on browning and sensory score of each sample

图2 不同反应时间样品的嗅香评价雷达图Fig.2 Radar chart of odor evaluation of samples with different reaction time

由图1可知，A420 nm数值随着反应时间的延长不断上升，且在0～60 min上升趋势较快，说明随着反应时间的延长，反应液中的氨基酸与还原糖不断发生反应，棕色物质不断增加，美拉德反应程度逐渐增大，且在0～60 min反应较为剧烈。感官评分随着反应时间的延长先升后降，在60 min时最大，超过60 min后逐渐下降，可能是由于棕色物质类黑精产生过量，经环化后生成了一些具有不良风味的物质。结合图2可知，反应时间为60 min时，样品的烘烤香及甜香较其他突出，药草香等较为和缓。因此，选择50～70 min为反应时间。

2.2 不同反应温度样品优化结果

不同反应温度样品在波长420 nm处的吸光度值及感官评分结果见图3，嗅香雷达图见图4。

图3 反应温度对各个样品褐变及感官评分的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on browning and sensory score of each sample

图4 不同反应温度样品的嗅香评价雷达图Fig.4 Radar chart of odor evaluation of samples under different reaction temperatures

由图3可知，A420 nm数值随着反应温度的增加不断上升，说明随着温度的升高，褐变速率越快，棕色物质不断增加。江敏等[19]的研究同样发现随着温度的升高，美拉德反应程度逐渐加深。感官评分随着反应温度的增加先升后降，在140 ℃时最大，超过140 ℃后下降，温度过高或过低都会影响产品的综合评分。当反应温度过低时，反应程度不够，产品香气不够浓郁饱满，反之，温度过高，反应剧烈，产品色泽较深且杂味物质增多，焦糊味较重。结合图4可知，反应温度为140 ℃时，样品的果香、烘烤香、膏香、甜香较其他突出，药草香较为和缓。因此，选择130～150 ℃为反应温度。

2.3 不同初始pH样品优化结果

不同初始pH的样品在波长420 nm处的吸光度值及感官评分结果见图5，嗅香雷达图见图6。

图5 初始pH对各个样品褐变及感官评分的影响Fig.5 Effect of initial pH value on browning and sensory score of each sample

图6 不同初始pH样品的嗅香评价雷达图Fig.6 Radar chart of odor evaluation of samples with different initial pH values

由图5可知，A420 nm数值随着初始pH的增加不断上升，这与顾宗珠等[20]的研究结果一致，感官评分随着初始pH的增加先升后降，在pH为8.0时最大。初始pH值过高或过低都会影响产品的整体风味，在低pH值条件下，氨基以质子化形式存在，阻碍了与还原糖的羰氨缩合，不利于美拉德反应的发生，得不到大量的芳香物质，致使综合评分不高。反之，在高pH值条件下，反应较强烈，褐变较严重，会产生一些风味不好的物质，破坏产品风味。结合图6可知，初始pH为8.0时，样品的果香、烘烤香、膏香、甜香较其他突出，药草香较为和缓。因此，选择6.0～8.0为初始pH。

2.4 不同料液比样品优化结果

不同料液比的样品在波长420 nm处的吸光度值及感官评分结果见图7，嗅香雷达图见图8。

图7 不同配比对各个样品褐变及感官评分的影响Fig.7 Effects of different ratios on browning and sensory score of each sample

图8 不同配比样品的嗅香评价雷达图Fig.8 Radar chart of odor evaluation of samples with different ratios

由图7可知，A420 nm数值随着罗汉果提取物占比的增加不断上升，感官评分随着料液比的增加先升后降，在罗汉果提取物与焦糖化料液的配比为4∶1时最大。推测主要是罗汉果自身的还原糖与氨基酸发生美拉德反应产生棕色物质，当罗汉果提取物的占比增加时，棕色物质增加。结合图8可知，焦糖化料液占比较大时(1∶1)，样品的甜味较为突出，罗汉果提取物占比较大时(5∶1)，样品的甜味较小，在罗汉果提取物与焦糖化料液的配比为4∶1时，各种味道较为均衡，总体评分最高。因此，选择罗汉果提取物与焦糖化料液的配比为3∶1、4∶1、5∶1。

2.5 正交试验

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，R值B>D>A>C，根据正交试验设计原理[21]，即各因素影响大小顺序为反应温度>料液比>反应时间>初始pH。最佳的反应条件组合为A1B1C3D2，即反应时间50 min、反应温度130 ℃、初始pH 8.0、罗汉果提取物与焦糖化料液的配比4∶1。对此条件下的样品进行验证试验测得A420 nm为0.812，感官评分为19.5，嗅香结果显示样品的果香、烘烤香、膏香、甜香、药草香都较明显，总体风味较好。

3 结论

本文以罗汉果为原料，将罗汉果提取物与葡萄糖焦糖化料液制成不同比例的掺配料进行加热催化美拉德反应，通过单因素试验比较了反应时间、反应温度、初始pH、料液比对掺配料的影响，利用正交试验确定了反应的最佳条件，即反应时间50 min、反应温度130 ℃、初始pH 8.0、罗汉果提取物与焦糖化料液的配比4∶1。在此条件下得到的罗汉果香料感官评分最高，果香、烘烤香、膏香、甜香、药草香都较明显，总体风味较好。

提高天然香料质量及产品的附加值已经成为香精香料行业的发展趋势，本研究采用美拉德反应制备罗汉果特色天然香料，掺配葡萄糖焦糖化料液提质增香，以感官评分为依据优化反应条件，具有突出的技术先进性，且该法工艺较为简单，设备要求较低，可为天然植物罗汉果的开发应用提供依据。