金果梨紫薯酵素混菌发酵工艺及其抗氧化活性

芮蓬，何佳*，刘锡铭，王涛

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.洛阳市微生物发酵工程技术研究中心，河南 洛阳 471023；3.河南尚长河果业有限公司，河南 洛阳 471000)

金果梨(Hoveniaacerba)俗称金果，呈扁圆形或近圆形，果皮较薄呈黄棕色，果肉石细胞较少、多汁[1]。果实中含有丰富的维生素、类黄酮、微量元素等物质，具有润肺止咳、提高免疫力等功效[2-3]。因其日常生长以及采收时极易发生机械损伤，每年会有大量残次果无法正常上市销售，造成大量果实浪费，影响种植户的经济收入。因此，金果梨深加工产品的研发迫在眉睫。目前金果梨的相关加工产品研究仅有孟令冬等[4]利用金果梨为原料制作了一款凝胶软糖，未见金果梨相关发酵产品的报道。

紫薯(purple sweet potato)又称黑薯，富含淀粉、可溶性糖、维生素、氨基酸、钙、磷、铁等多种营养成分[5]，此外，还富含硒元素和花青素[6]。在中医理论上，梨属寒性食物[7]，食用过多会对脾胃等产生伤害；紫薯属温性食物，可与梨的寒性形成阴阳互补[8]。

目前市场上的大部分果蔬发酵饮品主要为多菌种同时发酵的酵素与果醋。上述两种产品因在发酵过程中产生大量醋酸，饮用时酸度高、刺激性大[9-11]，不易被广大消费者接受，从而影响规模化原料加工生产。该酵素以金果梨和紫薯为原料，采用分阶段发酵方式，将酵母菌与醋酸菌、乳酸菌进行分阶段接种发酵。在酵母发酵阶段，利用巴氏杀菌技术及时杀灭酵母菌，降低终产物中醋酸含量，改善了产品的适口性。将金果梨与紫薯混合发酵，紫薯中丰富的花青素解决了梨汁发酵色泽单一的问题，同时发酵液的低pH环境也使花青素稳定保存[12]。本试验对乳酸菌和醋酸菌的混菌发酵工艺进行了优化，得到营养丰富、风味良好、酸度较低的发酵产品，增加了金果梨的日常消耗，同时使金果梨残次果得以利用，并对其抗氧化能力进行了研究，为金果梨紫薯酵素后续功能开发研究提供了试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

金果梨：河南尚长河果业有限公司培育的尚长河“金果”；紫薯：群紫1号，市售；高温α-淀粉酶(食品级，40 U/mg)、果胶酶(食品级，40 U/mg)、糖化酶(食品级，100 U/mg)：上海蓝季生物有限公司；酵母菌：葡萄酒·果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：沪酿曲种，成都曲赋生物科技有限公司；植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌：本实验室保藏。

DPPH(≥97%)：上海蓝季生物有限公司；ABTS(≥96.5%)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；MRS培养基、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；Tris-HCl(分析纯)：南京奥多福尼生物科技有限公司；浓盐酸(分析纯)：洛阳昊华化学试剂有限公司；其余试剂均为天津市德恩化学试剂有限公司分析级试剂。

1.1.2 主要仪器与设备

HH-S4电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；PH400 pH计 上海安莱立思仪器科技有限公司；SPX-250生化培养箱 北京市永光明医疗仪器公司；UV2100紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；TGL-16M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金果梨紫薯酵素工艺流程

1.2.2 操作要点

酶解：加入0.12%高温α-淀粉酶，混匀后于70 ℃水浴锅中酶解3 h，中间摇匀2～3次。取出后自然冷却至55 ℃，加入0.14%果胶酶和0.11%糖化酶，同上于55 ℃酶解2.5 h。

酵母发酵：待酶解液冷却至30 ℃以下，再接入0.003%的酵母菌，于27 ℃发酵18 h。

巴氏灭菌：酵母菌发酵结束后立即进行65 ℃巴氏灭菌30 min。

菌种活化：用等量的MRS培养基将冷藏的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌在37 ℃下活化培养20 h，然后按1∶1混合。用1%葡萄糖、0.05% KH2PO4、1%酵母浸粉配制的醋酸菌增殖培养基于115 ℃灭菌30 min，冷却后加入4%的无水乙醇和醋酸菌，于33 ℃活化48 h。

混菌发酵：巴氏杀菌后冷却至室温，接入活化的乳酸菌和醋酸菌。

1.2.3 混菌发酵单因素试验

研究在一定条件下，乳酸菌接种量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、醋酸菌接种量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)、发酵时间(1，2，3，4，5 d)、发酵温度(27，30，33，36，39 ℃)对总酸含量的影响，确定最佳混菌发酵条件范围。

1.2.4 混菌发酵响应面试验

在单因素试验的基础上，以乳酸菌接种量(A)、醋酸菌接种量(B)、发酵时间(C)和发酵温度(D)为变量，将发酵液感官评分与其总酸含量的加权综合评分(Y)作为响应值，进行金果梨紫薯混菌发酵响应面试验。响应面试验因素水平见表1。

表1 金果梨紫薯混菌发酵响应面试验因素水平表

1.2.5 抗氧化活性试验

按照参考文献[13-16]的方法，测定金果梨紫薯酵素对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧自由基的清除率，并与一定浓度的Vc进行对比，分析其抗氧化能力。

1.2.6 测定方法

总酸含量：采用GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》方法进行酸碱滴定(以乳酸计)。

1.2.7 感官评定

表2 产品感官评分标准表Table 2 Sensory scoring standards for products

1.2.8 加权综合分值Y的计算方法

参考李杨等[17]的方法，对金果梨紫薯酵素混菌发酵工艺进行双目标综合加权评分，因素集为U={总酸含量、感官评分}={U1、U2}，综合评分值为Y。U1、U2函数关系如下:

式中：Xa为总酸含量的无量纲转化值；Xb为感官评分的无量纲转化值；y1为总酸含量；y2为感官评分值。

将响应面试验两个目标结果代到综合评价函数进行计算，评价函数Y如下：

金果梨紫薯酵素发酵的总酸含量和感官评分对成品都具有重要意义，选取的分配权重为γ={0.40,0.60}，即γ1为总酸的权重系数(γ1=0.40)，γ2为感官评分的权重系数(γ2=0.60)。

DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧自由基清除率的测定：按照参考文献[13-16]的方法进行。

1.2.9 数据处理

试验数据重复3次，利用Origin 2018进行绘图，响应面试验采用Design Expert 8.0.6进行设计以及统计分析。

2 结果与分析

2.1 混菌发酵的单因素试验

2.1.1 乳酸菌接种量对总酸含量的影响

当醋酸菌接种量为0.03%时，于33 ℃发酵4 d，不同乳酸菌接种量对发酵液总酸含量的影响见图1。

图1 乳酸菌接种量对总酸含量的影响Fig.1 The effect of lactic acid bacteria inoculation amount on total acid content

由图1可知，随着乳酸菌接种量的增加，发酵液的总酸含量先上升后趋于平稳。接种量为2.5%时，总酸含量最高，为14.4 g/L。接种量较低时，乳酸菌菌种数量低，生长代谢缓慢，导致总酸含量较低[18]。接种量大于2.0%时，有限的营养物质会使乳酸菌产生种间竞争，因而总酸含量增长不明显[19]。因此，选择1.5%～2.5%为最佳接种范围。

2.1.2 醋酸菌接种量对总酸含量的影响

当乳酸菌接种量为2%时，于33 ℃发酵4 d，不同醋酸菌接种量对总酸含量的影响见图2。

图2 醋酸菌接种量对总酸含量的影响Fig.2 The effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid content

由图2可知，随着醋酸菌接种量的增加，发酵液的总酸含量先上升后下降。当接种量为0.03%时，总酸含量为15.12 g/L，达到最高，当接种量大于0.03%时，会出现菌体过早老化，影响发酵效果[20]，同时过量的醋酸菌在生长繁殖过程中会与乳酸菌竞争营养物质，降低总酸产量。因此，选择0.02%～0.04%为最佳接种范围。

2.1.3 发酵温度对总酸含量的影响

当乳酸菌接种量为2%、醋酸菌接种量为0.03%时，发酵4 d，不同发酵温度对总酸含量的影响见图3。

图3 发酵温度对总酸含量的影响Fig.3 The effect of fermentation temperature on total acid content

由图3可知，随着发酵温度的升高，发酵液的总酸含量呈现先上升后下降的变化。当发酵温度为36 ℃时，发酵液中总酸含量达到最高，为14.48 g/L。当温度较低时，乳酸菌和醋酸菌细胞内的生物酶等活性受到抑制，使其生长代谢变缓。温度过高时，乳酸菌与醋酸菌短时间内生长旺盛，导致菌体过早衰老[21]。因此，选取30～36 ℃为最佳发酵温度。

2.1.4 发酵时间对总酸含量的影响

当乳酸菌接种量为2%、醋酸菌接种量为0.03%时，在33 ℃下进行发酵，发酵液中总酸含量随发酵时间的变化情况见图4。

图4 发酵时间对总酸含量的影响Fig.4 The effect of fermentation time on total acid content

由图4可知，随着发酵时间的延长，发酵液的总酸含量不断上升最后趋于平稳，发酵6 d时总酸含量达到最高，为15.99 g/L。在4 d以前，发酵液中丰富的营养物质使乳酸菌和醋酸菌大量繁殖生长代谢，发酵液中的总酸含量急速上升，当发酵时间大于4 d以后，发酵液中的总酸含量达到一定水平，较低的pH环境抑制了乳酸菌的生长，使乳酸产生缓慢。同时发酵液中的酒精被大量消耗，醋酸菌无法继续产生醋酸，且菌体出现老化也会影响醋酸菌的产酸能力[22]，导致4 d以后发酵液中总酸含量上升平缓。因此，选择3～5 d为最佳发酵时间。

2.2 金果梨紫薯混菌发酵工艺优化

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，以乳酸菌接种量(A)、醋酸菌接种量(B)、发酵时间(C)和发酵温度(D)为评价因素，以发酵液的总酸含量与其感官评分的加权综合评分(Y)为指标进行响应面试验，结果见表3。

用Design Expert 8.0.6软件对结果进行分析，各发酵因素与加权评分之间的二次回归方程：Y=0.80-0.035A-7.799E-004B+0.18C-8.795E-003D+5.452E-003AB+1.618E-003AC+0.045AD-0.061BC-0.021BD-0.010CD-0.14A2-0.23B2-0.24C2-0.25D2。

表3 金果梨紫薯发酵工艺条件优化响应面试验设计与结果Table 3 Response surface test design and results of optimization of fermentation process conditions for Hovenia acerba and purple sweet potato

续 表

对该模型进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

由表4可知，该回归模型的F值为93.66，P值<0.0001，失拟项的P=0.5001>0.05，说明该模型的拟合度较好。确定系数R2=0.9894，较正系数RAdj2=0.9789，表明该回归方程的拟合程度高，可用于金果梨紫薯混菌发酵过程的分析和优化。由回归方程分析可知，不同发酵因素对综合评分的影响效果由大到小为发酵时间(C)>乳酸菌接种量(A)>发酵温度(D)>醋酸菌接种量(B)。各交互项中除AD对响应值的影响显著(P<0.05)，BC对响应值的影响极显著(P<0.01)，其余交互项对响应值的影响均不显著(P>0.05)，各二次项对响应值的影响均极显著(P<0.01)。

2.2.2 响应面图分析

对金果梨紫薯混菌发酵综合评分有显著影响的交互项为AD和BC，其响应曲面与等高线见图5。AD项与BC项均呈现椭圆形，说明具有较强的交互作用，同时BC交互项的响应曲面比AD交互项的响应曲面更加陡峭，印证了复合方差分析的BC交互项比AD交互项更加显著的结果。

图5 各因素对发酵综合评分的交互作用Fig.5 The interaction effect of various factors on the fermentation comprehensive scores

2.2.3 验证试验

通过建立的数学模型预测金果梨紫薯混菌发酵的最佳工艺条件为：乳酸菌接种量1.93%、醋酸菌接种量0.03%、发酵时间4.38 d、发酵温度32.89 ℃。考虑实际操作问题，将工艺条件修正为:乳酸菌接种量1.9%、醋酸菌接种量0.03%、发酵时间4.5 d、发酵温度33 ℃。在此条件下进行5次平行试验，综合评分为0.833，与理论预测评分0.841误差较小，说明该模型可以较好地预测金果梨紫薯的发酵工艺，具有实际参考价值。

2.3 抗氧化活性

因紫薯中的花青素被释放到发酵液中，金果梨紫薯酵素经6倍稀释后对4种自由基仍具有清除率。由图6可知，DPPH自由基的清除率为72.66%，ABTS自由基的清除率为82.11%，在同等情况下，0.01 mg/mL的Vc对上述两种自由基的清除率分别为57.27%、60.72%。羟基自由基的清除率为73.53%，超氧自由基的清除率为6.60%，在同等情况下，0.2 mg/mL的Vc对上述两种自由基的清除率分别为82.26%、71.51%。金果梨紫薯酵素虽对超氧自由基的清除率较低，综合评价其仍具有较强的抗氧化能力。

图6 金果梨紫薯酵素对不同自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of Hovenia acerba and purple sweet potato enzyme on different free radicals

3 结论

本试验以金果梨紫薯酵母发酵液为原料，通过单因素试验以及响应面试验对其混菌发酵工艺进行优化，确定最佳工艺条件为乳酸菌接种量1.9%、醋酸菌接种量0.03%、发酵时间4.5 d，发酵温度33 ℃，产品的综合评分可达到0.833。其总酸度约为15 g/L，低于果醋的国标(25 g/L)，使消费者更易接受，且该酵素具有较强的抗氧化能力，符合将其作为日常饮品的需求。本试验优化了金果梨紫薯的混菌发酵工艺，提高了产品的可接受性，在一定程度上解决了金果梨残次果问题。