‘白兰地’海棠不同花期与不同花器官的香气成分分析

周晨晨，范俊俊，谭瑞楠，杨 峰，张往祥

（1.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.金陵科技学院园艺与园林学院，江苏 南京 210038；3.青岛市政监理咨询有限公司，山东 青岛 266000）

0 引言

【研究意义】花香是园林植物重要的观赏形状，被誉为花卉的“灵魂”[1]，是植物诱引昆虫授粉的重要表达信号，也是评价观赏植物和鲜切花的重要品质指标。花香挥发物按照生物合成途径可将这些化合物分为萜烯类、苯丙酸类/苯环型化合物和脂肪族化合物等3大类[2]。花香比花色和花型更能影响消费者的选择[3]。常见的花卉育种工作大多集中于花型、花色、花期等方面，而忽视了香花的育种[4]。更为多元化的花香研究可以了解植物开花过程中香气的差异变化，明确花香释放的关键部位，为不同植物花朵香气形成机理的研究、芳香新品种的培育和后续花香代谢研究奠定基础，同时也为鲜花加工产业提供科学的指导。【前人研究进展】学者们在对花朵挥发物的鉴定上进行了诸多试验，对园林植物的花香成分组成进行了研究，包括桂花[5]、蜡梅[6]、兰花[7]、玫瑰[8]、茉莉[9]等。植物花朵香气的释放往往因为开花阶段的不同而呈现一定的变化，不同花器官所释放的香气也有差异，目前学者对于花香的研究也不局限于简单的定量定性分析，更多的是研究花朵香气释放的部位和规律，以及尝试寻找花香与花色、传粉者之间的联系。比如对水仙花花香的昼夜规律和不同花龄的花香研究发现夜间产生的气味明显少于白天，花被结构加倍的复花产生双倍的香味[10]。从花的不同部位研究了大花蕙兰“阳光钟”的挥发性成分，鉴定出23种成分[11]。红苹果“佩林戈”的成熟花挥发性气味分析发现芳樟醇含量最高，在花蕾中为43.0%，在花柱和柱头顶部空间中为17.6%[12]。以及对桂花[5]、杜鹃[13]、茶梅[14]、野茉莉[15]等植物的花香释放规律研究，结果都显示随着花期的变化花香而呈现不同的变化规律。海棠（Malus）是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）中果实直径较小（≤5 cm）的一类植物的总称，是优良的观花、观叶和观果树种。目前国内外海棠良种选育工作主要是围绕观花、观叶和观果等目标性状展开，鲜见以香花为目标性状的改良育种研究。中国的传统观点是，盛开的海棠花美丽而不芳香[16]。然而，长期的自然选择和人工育种已在全球范围内培育出700多个海棠品种[17-19]，其中大多数品种都是芳香的[16]。李晓磊[20]、Omata等[21]和Zhao等[16]基于少数海棠种质花香成分检测发现海棠花香主要成分是异戊醇、苄醇、3-甲基-4-氧络戊酸、罗勒烯、庚烷等物质。【本研究切入点】但这些研究仅仅局限于少量品种的花香定性上，对于海棠花香的释放规律研究较少。在进行芳香花卉育种或花卉调控，甚至精油提取时，了解植物的花香特性和释放规律至关重要。【拟解决的关键问题】因此，为了研究海棠的花香释放规律，针对花量较大、重瓣、花朵呈深粉红、气味浓郁的北美海棠品种‘白兰地’海棠（M.'Brandywine'），本研究采用 SPME-GC-MS 技术对‘白兰地’海棠的花朵开放过程中（大蕾期、初花期、盛花期、末花期）花香的释放规律、不同花朵部位（花瓣、雄蕊、雌蕊及剩余部分）的香气成分进行分析，研究花香特征及释放规律，为后续海棠花香代谢研究及成分的鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

于2021年4月选取来自国家海棠种质资源库（扬州市江都区，东经 119°55′，北纬 32°42′）的健康且长势相近的‘白兰地’海棠（M.'Brandywine'）作为供试材料，于天气晴朗的上午7:00～9:00收集‘白兰地’海棠花朵处于大蕾期（蕾膨大，雌雄蕊即将显露）、初花期（花朵即将开放，雌雄蕊显露）、盛花期（花朵完全开放且柱头和花药新鲜，色彩明艳）、末花期（柱头和花药干萎，花瓣未干萎）的花枝，采摘后及时插入湿沙，带回实验室并对每个花期准确称取4 g花朵进行挥发性成分测定。并且对盛花期的花朵解剖成花瓣、雄蕊、雌蕊及剩余部分（雌蕊、萼片、萼筒），每个部分准确称取2 g进样分析。以上试验均设置3个重复。

1.2 GC-MS分析

选取配有 65 μm PDMS-DVB（二乙烯基苯）萃取头的固相微萃取仪（Supelco，USA）进行花香成分收集和吸附。萃取头首次使用时在气相色谱进样口中以 270 ℃的高温活化0.5 h，以后每次进样前都活化3 min，不同花期样品每次处理取4 g花朵置于250 mL顶空瓶中，不同花器官样品每次处理取2 g花朵置于20 mL顶空瓶中，萃取深度约2.5～3.0 cm，于水浴加热45 ℃条件下顶空萃取35 min后，立即插入气相色谱进样口进行解析，每个单元设置3个重复。

气质联用仪Trace DSQ （Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA）。气相条件：DB-5MS（非极性柱，长30 m，内径0.25 mm，液膜厚0.25 μm），载气为高纯He，柱流量1.0 mL·min-1不分流进样；进样口温度250 ℃，热解析3 min，不分流进样；起始温度 50 ℃，保持 1 min，以 10 ℃·min-1升至 100 ℃，不停留，再以 5 ℃·min-1升至 160 ℃，保持 4 min，再以8 ℃·min-1升至220 ℃，不停留。质谱条件：离子源温度230 ℃，电离方式EI+，电子能量70 eV，检测器电压1 200 V，质量扫描范围：33-450 aMU，全扫描方式，扫描时间0.5 s，传输线温度230 ℃。

1.3 数据分析

将得到的质谱数据与美国国家标准与技术研究所NIST谱库提供的标准物质的质谱图进行比对，通过（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）网站进行检索，同时根据在相同升温程序下用正构烷烃标准样品（C8～C20）计算得到科瓦茨保留指数（Kovats’Retention Indices，RI）和NIST网站上对应物质所列举的相关参考文献进行进一步定性确认，鉴定出主要挥发性成分。根据离子流峰面积归一化法计算出样品中各香气物质的相对含量。使用Origin 2019b（OriginLab, MA, USA）和 Systat 13（Systat Software Inc., CA, USA）对挥发性成分进行主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

2.1 ‘白兰地’海棠不同花期的挥发性成分分析

‘白兰地’海棠4个时期的挥发性成分的总释放量呈现先上升后下降的趋势，在盛花期达到最高（图1）。在4个花期中共检测到50中挥发性化合物（表1），其中大蕾期23种，初花期30种，盛花期30种，末花期32种。这些挥发性化合物主要包括6种萜烯类、15种酯类质、4种醇类、13种烷烃类、9种醛酮类和3种酚类。

表1 ‘白兰地’海棠不同花期的挥发性成分鉴定Table 1 Identification of volatiles in different flowering stages of Malus Brandywine

图1 ‘白兰地’不同花期挥发性成分的峰面积图Fig.1 Peak areas of Malus Brandywine volatiles at different flowering stages

4个花期检测出的挥发性成分主要以萜烯类、酯类、醛酮类、烷烃类、醇类和酚类为主，但不同时期的种类构成不完全相同（图2）。酚类物质只在盛花期和末花期检测出，在‘白兰地’海棠花香释放总量中占的比重极少。萜烯类挥发性成分相对含量在花朵开放过程中先上升后下降，在盛花期达到最高（37.3%），而烷烃类和酯类呈现先下降后上升的趋势。大蕾期主要成分以醛酮类（38.78%）和烷烃类（22.81%）为主，在整个开花过程中的相对含量最高，萜烯类和酯类的相对含量相差较小。初花期以萜烯类和酯类为主，酯类（24.88%）在初花期达到最高。萜烯类和醛酮类是盛花期花香释放的主要种类，占盛花期总释放量的70.88%，而这个时期的酯类和烷烃类成分所占比重在4个时期中最低，酚类物质（4.26%）也主要出现在盛花期。末花期和盛花期花香成分释放类别种类与相对含量相似，醇类成分在末花期达到最高（9.52%）。

图2 不同花期挥发性成分种类的相对含量比较Fig.2 Relative contents of volatiles in floral organs at different flowering stages

‘白兰地’海棠不同花期的挥发性成分组成和释放量不同。大蕾期的主要成分是叶醇（9.00%）、甲基庚烯酮（14.98%）、乙酸叶醇酯（9.37%）、壬醛（18.48%）、α-法 呢 烯（14.47%） 和 正 十 二 烷（10.46%），在大蕾期的相对含量均高于初花期、盛花期和末花期，其中壬醛在其他3个花期中相对含量较低或极地而无法检测出。初花期的主要成分是叶醇（7.71%）、己酸甲酯（11.67%）、甲基庚烯酮（10.39%）、芳樟醇（25.19%），这些成分的相对含量高于盛花期和末花期，整体释放量呈现下降的趋势。盛花期的主要成分是己酸甲酯（7.12%）、芳樟

醇（14.75%）、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（9.74%）和2-十三烷酮（11.44%），虽然盛花期和初花期检测出来的成分数量相同，但盛花期花香总释放量（2.49×109）远高于初花期（1.38×109）（图1）。末花期的主要成分是甲基庚烯酮（7.56%）、己酸甲酯（7.31%）、芳樟醇（13.05%）、4-亚甲基异佛尔酮（8.56%）和α-法呢烯（7.28%），除了4-亚甲基异佛尔酮，其他主要成分相对含量在4个时期中基本呈现下降趋势。4个时期中盛花期和末花期的主要挥发性成分组成结构较相似。(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、对甲苯甲醚和苯乙醇在盛花期和末花期的相对含量均较高，但在大蕾期和初花期均未检测出，相对含量较高的芳樟醇在除了大蕾期的3个时期均检测出，且呈现下降趋势。在各个花期中，共有成分有10种，叶醇、芳樟醇、己酸甲酯、甲基庚烯酮和α-法呢烯等在大蕾期、初花期和盛花期的含量较高（4.40%～25.19%），为‘白兰地’海棠主要挥发性成分。

2.2 ‘白兰地’海棠不同花器官的挥发性成分分析

‘白兰地’海棠不同花器官中雌蕊的挥发性成分的总释放量最高，花瓣最低（图3）。在4个花期中共检测到45中挥发性化合物（表2），其中花瓣28种，雌蕊（含花萼）32种，雄蕊25种。这些挥发性化合物主要包括6种萜烯类、17种酯类质、4种醇类、7种烷烃类、8种醛酮类和3种酚类。

表2 ‘白兰地’海棠不同花器官的挥发性成分鉴定Table 2 Identification of Malus Brandywine volatiles in floral organs

图3 ‘白兰地’不同花器官挥发性成分的峰面积图Fig.3 Peak areas of Malus Brandywine volatiles in floral organs

‘白兰地’海棠不同花器官的挥发性成分组成和释放量不同。花瓣中主要成分是己酸甲酯（35.41%）、芳樟醇（10.01%）和辛酸甲酯（13.60%），整朵花中己酸甲酯和辛酸甲酯的释放主要集中在花瓣。雌蕊中主要成分是叶醇（5.84%）、乙酸叶醇酯（20.47%）、α-法呢烯（34.12%）和（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（6.03%），其中（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯仅在雌蕊中检测出，整朵花中乙酸叶醇酯和α-法呢烯的释放集中于雌蕊。雄蕊中主要成分是甲基庚烯酮（7.75%）、芳樟醇（23.59%）、4-辛烯酸甲酯（12.33%）、苯乙醇（11.04%）和4-亚甲基异佛尔酮（12.06%），其中苯乙醇为雄蕊中独有的挥发性成分，芳樟醇、4-辛烯酸甲酯和4-亚甲基异佛尔酮的主要释放也在雄蕊。在不同的花器官中，检测出的共有挥发性成分共12种，这些成分大多都不是‘白兰地’海棠的主要挥发性成分，主要成分均集中于某一器官。此外，花器官检测出的挥发性成分种类与花期有差异，雌蕊中特异成分种类达11种，主要是酯类、醇类和醛酮类物质，这可能是由于花朵解剖造成解剖伤口导致有其他成分被检测出。

不同花器官的挥发性成分释放种类构成不同（图4）。在数量上，3种器官中酯类的成分数量差别最大，最高的是雌蕊（12种），最低的是雄蕊（6种）。在相对含量上，3种花器官差别最大的是酯类物质，最小的是烷烃类。花瓣中检测出的挥发性成分种类以酯类（57.86%）、醛酮类（17.85%）和萜烯类（15.63%）为主，占花瓣挥发性成分总释放量的91.34%。雌蕊中以萜烯类（47.64%）和酯类（41.26%）为主，占雌蕊挥发性成分总释放量的88.9%。雄蕊以萜烯类（32.09%）和醛酮类（25.68%）为主，占雄蕊挥发性成分总释放量的57.77%。

图4 不同花器官挥发性成分种类的相对含量比较Fig.4 Relative contents of volatiles in floral organs

2.3 基于PCA的不同花期与花器官挥发物的差异性分析

为了进一步分析不同时期、不同花器官与挥发性成分之间的差异关系，基于不同花期的50个挥发性成分和不同花器官的45个挥发性成分，对4个时期和3个花器官成分数据进行了主成分分析。

结果表明，对于不同花期与挥发性成分之间（图5-A），第一主成分（PC1）贡献率达65.03%，第二主成分（PC2）贡献率达22.43%，前两个主成分占总方差的87.46%，说明能很好地反映所测样品的整体信息特征。在PC1负方向上，甲基庚烯酮、乙酸叶醇酯、壬醛、正十二烷和α-法呢烯的贡献较大，说明这些成分与大蕾期呈正相关关系。（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯和2-十三烷酮PC1和PC2正方向上的贡献较大，与盛花期和末花期呈正相关关系，是这两个时期的主要挥发性成分。己酸甲酯和芳樟醇在PC1正方向上和PC2负方向上的贡献较大，与初花期呈正相关关系，是初花期的主要成分。4个时期除了盛花期和末花期位于同一坐标象限，其余2个时期分布较为分散，没有重叠，表明在整个花开放过程中，花香成分释放存在差异，且盛花期和末花期的挥发性成分组成结构较相似。

图5 挥发性成分的主成分分析Fig.5 Principal component analysis based on volatiles

对于不同花器官与挥发性成分之间（图5-B），第一主成分（PC1）贡献率达到61%，第二主成分（PC2）贡献率达到37.65%，前两个主成分占总方差的98.65%，能很好地反映所测样品的整体信息特征。己酸甲酯、乙酸叶醇酯、芳樟醇和α-法呢烯在PC1和PC2上的贡献较高，说明这些成分是花器官香气释放的主要挥发性成分。其中乙酸叶醇酯和α-法呢烯在PC1的正方向上贡献最大，与雌蕊呈正相关关系。己酸甲酯、辛酸甲酯和2-十三烷酮在PC2的正方向上贡献较大，与花瓣呈正相关关系，是花瓣中检测出的主要挥发性成分。芳樟醇、4-辛烯酸甲酯、苯乙醇和4-亚甲基异佛尔酮在PC2的负方向上贡献较高，与雄蕊呈正相关关系，是雄蕊中检测出的主要挥发性成分。3种花器官均位于不同象限，分布较为分散且无重叠，表明不同花器官的花香成分存在差异。

3 讨论

相对于花型、花色等植物性状，花香的研究相对滞后[22]。目前，已鉴定出近100个植物科的2 000多种花香化合物。在这些化合物中，萜烯类化合物是植物花香化合物中最大的一个类群，在许多植物的挥发性成分中占很大比例，它们不仅对植物的气味有影响，还会对植物花色产生一定的影响[23]。Schiestl等[24]研究发现，萜烯类和苯丙烷类化合物是散发吸引授粉者信号的主要物质。邹晶晶等[25]发现萜烯类化合物是12个桂花品种中的主要香气活性物质。章辰飞等研究发现2种杜鹃花中萜烯类物质的组分最多，对花香的贡献最大[26]。徐瑾等[27]发现菊花进入盛花期后萜烯类物质达到最高，占总香气成分的37.40%。陈艺荃等[28]对不同品种的杂交兰香气研究也发现花香主要成分是萜烯类化合物。程劼等[29]研究发现，萜烯类化合物是蔷薇科植物玫瑰精油头香香气的重要组成成分，使其具有天然香气。周围等[30]对苦水玫瑰油香气分析也发现单萜类化合物占极大比例。本研究对蔷薇科植物‘白兰地’海棠不同花期的花香检测中共发现了50种挥发化合物，其中萜烯类物质在初花期、盛花期和末花期均占主导地位，相对含量在盛花期达到最高，占总香气成分的37.3%。

诸多对植物开花过程中香气的研究表明，随着花瓣的展开，植物的花香释放会发生变化[25-27]。孙亚如等[8]研究发现盛开期是‘单县玫瑰’油用的最佳采收期。徐瑾等[27]发现菊花在花朵开放过程中香气成分的种类和含量先增多后减少，均与本研究结果相似。本研究中4个时期分别检测出23、30、30、32种挥发性成分，4个时期的挥发性成分的总释放量呈现先上升后下降的趋势，在盛花期达到最高。其中主要成分芳樟醇在初花期相对含量达到最高（25.19%），随着花朵的开放与衰败，芳樟醇释放量逐渐下降。对不同花期与花香成分之间作PCA后也显示芳樟醇在PC1正方向上的贡献较高，虽然释放量下降，但依然是初花期、盛花期和末花期的主要挥发性成分之一。壬醛和α-法呢烯的在PC1负方向上贡献较大，与大蕾期呈正相关关系；α-法呢烯在大蕾期之后释放量开始下降，但其余3个时期相对含量差别较小，而壬醛仅在大蕾期检测出。PCA结果显示在整个花开放过程中，花香成分释放存在差异，且盛花期和末花期的挥发性成分组成结构较相似。

植物香气的释放不仅于花期有关，也有花朵的器官组成有关，花香的物质基础是花朵不同器官产生的易挥发次生代谢产物，花朵各部分对花香释放的贡献不是等同的，这种空间差异是普遍存在的[31]。一般认为花瓣是花香挥发物合成及释放的主要部位[32]，但雄蕊、雌蕊、花萼或者其他部分也可能是主要香气来源，或者释放某种具有独特贡献的化合物。本研究中在花瓣、雌蕊（含花萼）和雄蕊中分别检测出28、32、25种挥发性成分。雌蕊的挥发性成分的总释放量最高，花瓣最低，说明雌蕊可能是整朵花香气释放的主要器官。花瓣中主要成分是己酸甲酯、芳樟醇和辛酸甲酯，雌蕊中主要成分是叶醇、乙酸叶醇酯、α-法呢烯和（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯，雄蕊中主要成分是甲基庚烯酮、芳樟醇、4-辛烯酸甲酯、苯乙醇和4-亚甲基异佛尔酮，其中苯乙醇为雄蕊中独有的挥发性成分。主要成分芳樟醇仅在雄蕊和花瓣中检测出，其含量在雄蕊中达到最高，雌蕊中并未检测出芳樟醇。花器官中检测出的共有挥发性成分共12种，但这些成分大多都不是‘白兰地’海棠的主要挥发性成分，主要成分均集中于某一器官。PCA结果也显示，己酸甲酯、乙酸叶醇酯、芳樟醇和α-法呢烯等主要成分分别与花朵的不同器官高度相关。

4 结论

叶醇、芳樟醇、己酸甲酯、乙酸叶醇酯、甲基庚烯酮和α-法呢烯为‘白兰地’海棠主要挥发性成分。随着花朵开放，挥发性成分的总释放量呈现先上升后下降的趋势，在盛花期达到最高，不同时期的香气成分种类构成不完全相同，主要以萜烯类和醛酮类为主，分别在盛花期和大蕾期达到最高。盛花期花朵雌蕊是挥发性成分释放的主要花器官，不同花器官的花香成分存在明显差异。